伴失眠的肝腎陰虛型系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者睡眠結(jié)構(gòu)與Treg細(xì)胞、細(xì)胞因子的關(guān)系研究

胡曉輝，呂婷婷，劉春瑩

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，陜西 西安 710038；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，病變部位在全身結(jié)締組織，且常多系統(tǒng)、多臟器受累。而SLE中醫(yī)辨證類型較多，較常見(jiàn)的為熱毒血瘀、肝腎陰虛、風(fēng)濕痹阻及氣血虧虛四型。其中，SLE病程后期以肝腎陰虛型多見(jiàn)，該型患者多伴有失眠。腎陰虛是引起失眠的重要病機(jī)，肝腎同源，故肝腎陰虛是導(dǎo)致失眠的關(guān)鍵所在。研究顯示，外周血Treg細(xì)胞表達(dá)異?；蛘邤?shù)量變化，引起體內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致過(guò)多自身抗體及細(xì)胞因子產(chǎn)生，最終引起SLE發(fā)病。而有關(guān)Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子在肝腎陰虛型SLE患者表達(dá)及與其睡眠結(jié)構(gòu)變化是否存在潛在的關(guān)系，查閱文獻(xiàn)罕有報(bào)道。本文擬通過(guò)觀察伴失眠的肝腎陰虛型SLE患者睡眠結(jié)構(gòu)、Treg細(xì)胞、細(xì)胞因子表達(dá)變化，探討研究肝腎陰虛型SLE患者免疫功能紊亂與失眠的關(guān)系，失眠程度與Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）1997年推薦的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)及SLE疾病活動(dòng)度評(píng)分（SLEDAI）標(biāo)準(zhǔn)[1]，并參照2002年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局修訂的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[2]中SLE中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)。失眠西醫(yī)診斷符合2001年《CCMD-3中國(guó)精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》[3]中診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)診斷符合1993年《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（第一輯）》[4]中制定的失眠中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合以上所述西醫(yī)診斷及中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)的受試者；（2）年齡18～70周歲；（3）SLEDAI積分為非活動(dòng)期患者（SLE-DAI≤10分）；（4）匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（Pittsburg sleep quality index，PSQI）總分＞7分；（5）入組前2周內(nèi)沒(méi)有相關(guān)鎮(zhèn)靜安神類藥物服用史；（6）自愿參與本研究并簽署知情同意書；（7）臨床資料完備，并能接受定期隨訪。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 重度SLE活動(dòng)型患者；合并其它風(fēng)濕病或自身免疫性疾病者；合并各系統(tǒng)靶器官嚴(yán)重病變、血液病、腫瘤、各種急性感染及精神病等為非SLE所致者；合并認(rèn)知功能障礙，無(wú)法完成PSQI測(cè)評(píng)者；不能耐受多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)者；近半年內(nèi)使用免疫抑制劑者；哺乳期或者妊娠期婦女；對(duì)本研究不能耐受者。

1.4 研究對(duì)象及分組 選取2018年7月至2019年9月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕腎病二科就診的SLE患者63例，其中男11例，女52例；年齡35～70（50.92±7.88）歲。本研究通過(guò)陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審核，所有受試者均簽署知情同意書。納入患者分為3組：肝腎陰虛型SLE組（LKYD-SLE）、短期失眠肝腎陰虛型SLE組（SI-LKYD-SLE）、長(zhǎng)期失眠肝腎陰虛型SLE組（LI-LKYD-SLE），各21例。其中，LKYD-SLE組不伴失眠，SLEDAI≤10分；SI-LKYD-SLE組失眠≤3個(gè)月，SLEDAI≤10分；LI-LKYD-SLE組失眠＞3個(gè)月，SLEDAI≤10分。

1.5 觀察指標(biāo)（1）測(cè)評(píng)PSQI、漢密爾頓焦慮量表（Hamilton anxiety scale，HAMA）、漢密爾頓抑郁量表（Hamilton depression scale，HAMD）、多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)（PSG）相關(guān)睡眠參數(shù)（睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間、睡眠效率）。由固定的專業(yè)量表評(píng)定人員對(duì)入組患者進(jìn)行PSQI、HAMA、HAMD評(píng)測(cè)，采用飛利浦偉康A(chǔ)6多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)儀對(duì)入選受試者進(jìn)行連續(xù)7 h夜間睡眠監(jiān)測(cè)，記錄睡眠參數(shù)。（2）檢測(cè)外周血IgG、IgA、IgM、C3、C4、紅細(xì)胞沉降率（ESR）水平。儀器采用西門子BNⅡ全自動(dòng)蛋白分析儀，采集受試者空腹外周靜脈血5 mL，離心提取血清，嚴(yán)格按照西門子BNⅡ全自動(dòng)蛋白分析儀的SOP操作規(guī)程執(zhí)行，運(yùn)用散射速率免疫比濁法檢測(cè)血清IgG、IgA、IgM、C3、C4含量，采用魏氏法檢測(cè)外周血ESR。（3）檢測(cè)Treg細(xì)胞表達(dá)。采用BD FACSAriaⅡ流式細(xì)胞儀和美國(guó)eBioscience公司提供的試劑，運(yùn)用BD FACSDIVA 6軟件分析Treg細(xì)胞的表達(dá)，空腹抽取受試者外周靜脈血5 mL，肝素鈉抗凝并提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)分子后清洗，采用流式細(xì)胞儀對(duì)Treg細(xì)胞（Foxp3+CD25highCD4+）進(jìn)行檢測(cè)。（4）檢測(cè)外周血轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10水平。采集受試者空腹外周靜脈血5 mL，離心提取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)外周血TGF-β、IL-6、IL-10含量，所用試劑為上海晶抗生物工程有限公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理分析，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用例和率（%）表示。計(jì)量資料比較采用One-way ANOVA（單因素方差分析），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料3組患者基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。（見(jiàn)表1）

表1 3組患者基線資料比較

2.2 3組患者PSQI、HAMA、HAMD評(píng)分比較SI-LKYD-SLE組、LI-LKYD-SLE組患者PSQI、HAMA、HAMD評(píng)分均高于LKYD-SLE組患者（P＜0.01），且隨著失眠時(shí)間增長(zhǎng)，LI-LKYDSLE患者PSQI、HAMA、HAMD評(píng)分均高于SI-LKYD-SLE組患者（P＜0.01）。（見(jiàn)表2、圖1）

表2 3組患者PSQI、HAMA、HAMD評(píng)分比較（±s，分）

表2 3組患者PSQI、HAMA、HAMD評(píng)分比較（±s，分）

注：與LKYD-SLE組比較，aP＜0.01；與SI-LKYD-SLE組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù) PSQI HAMA HAMD LI-LKYD-SLE組21 16.83±1.45b 17.81±2.85b 20.18±2.82b SI-LKYD-SLE組 21 11.15±1.63a 12.37±2.11a 12.73±2.36a LKYD-SLE組 21 4.91±1.20 6.22±1.42 6.70±1.52 F 381.5 149.3 188.1 P 0.000 0.000 0.000

圖1 3組患者PSQI、HAMA、HAMD評(píng)分散點(diǎn)圖

2.3 3組患者PSG監(jiān)測(cè)睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間、睡眠效率比較SI-LKYD-SLE組、LI-LKYD-SLE組患者睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間均高于LKYD-SLE組（P＜0.01），并且隨失眠時(shí)間增長(zhǎng)，LI-LKYD-SLE組患者睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間均高于SI-LKYD-SLE組（P＜0.01）。相反，SI-LKYD-SLE組、LI-LKYD-SLE組 患 者 睡 眠 效 率 低 于LKYD-SLE組（P＜0.01），LI-LKYD-SLE組患者睡眠效率低于SI-LKYD-SLE組（P＜0.01）。（見(jiàn)表3、圖2）

圖2 3組患者PSG監(jiān)測(cè)睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間、睡眠效率比較散點(diǎn)圖

表3 3組患者PSG監(jiān)測(cè)睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間、睡眠效率比較（±s）

表3 3組患者PSG監(jiān)測(cè)睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間、睡眠效率比較（±s）

注：與LKYD-SLE組比較，aP＜0.01；與SI-LKYD-SLE組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù) 睡眠潛伏期（min）覺(jué)醒次數(shù)（t）覺(jué)醒時(shí)間（min） 睡眠效率（%）LI-LKYD-SLE 組21 51.05±9.57b 8.5組21 38.05±7.45a 4.4 21 18.67±4.44 2.45±2.62b 57.52±9.37b 64.48±6.41b SI-LKYD-SLE3±1.70a 36.62±7.63a 78.52±5.11a LKYD-SLE組 6±1.15 20.05±5.1 88.90±4.59 F 100.2 58.58 103.2 107.3 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 3組患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表達(dá)比較SILKYD-SLE組、LI-LKYD-SLE組患者IgG、IgA、IgM、ESR均高于LKYD-SLE組（P＜0.01），LI-LKYD-SLE組患者IgG、IgA、IgM、ESR顯著高于SI-LKYD-SLE組（P＜0.01）。相反，SI-LKYDSLE組、LI-LKYD-SLE患者C3、C4均低于LKYD-SLE組（P＜0.01），LI-LKYD-SLE組患者C3、C4低于SI-LKYD-SLE組（P＜0.001）。（見(jiàn)表4、圖3）

表4 3組患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表達(dá)比較（±s）

表4 3組患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表達(dá)比較（±s）

注：與LKYD-SLE組比較，aP＜0.01；與SI-LKYD-SLE組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù) IgG(g/L) IgA(g/L) IgM(g/L) C3(g/L) C4(g/L) ESR(mm/h)LI-LKYD-SLE組21 34.05±4.455.31±0.79 24.43±2.79a 3.88±0.65b b 2.45±0.51b 0.54±0.24b 0.26±0.08b 55.87±4.99b SI-LKYD-SLE組21a 1.66±0.37a 0.83±0.26a 0.47±0.10a 46.23±3.32a LKYD-SLE組 21 16.43±2.81 3.08±0.48 1.37±0.34 1.02±0.27 0.59±0.13 39.69±2.86 F 138.2 63.30 38.28 17.98 49.97 94.61 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 3組患者外周血中IgG、IgA、IgM、C3、C4、ESR表達(dá)比較散點(diǎn)圖

2.5 3組患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比較SI-LKYDSLE組、LI-LKYD-SLE組患者Treg細(xì)胞、TGF-β低于LKYDSLE組（P＜0.01），且LI-LKYD-SLE組患者Treg細(xì)胞、TGF-β顯著低于SI-LKYD-SLE組（P＜0.001）。相反，SI-LKYD-SLE組、LI-LKYD-SLE組患者IL-6、IL-10均高于LKYD-SLE組（P＜0.01），LI-LKYD-SLE組患者IL-6、IL-10均顯著高于SI-LKYD-SLE組（P＜0.01）。（見(jiàn)表5、圖4）

圖4 3組患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比較散點(diǎn)圖

表5 3組患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比較（±s）

表5 3組患者外周血Treg、TGF-β、IL-10、IL-6比較（±s）

注：與LKYD-SLE組比較，aP＜0.01；與SI-LKYD-SLE組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù)Treg（%）TGF-β（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL-6（pg/mL）LI-LKYD-SLE組21 2.85±0.33b 20.81±2.45b 19.44±1.69b 77.20±5.52b SI-LKYD-SLE組21 3.81±0.34a 25.15±2.56a 14.86±1.43a 61.07±4.86a LKYD-SLE組 21 5.02±0.46 34.48±3.76 11.17±1.27 50.05±4.08 F 170.9 115.2 166.0 166.0 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討 論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種自身免疫性結(jié)締組織病，由于體內(nèi)產(chǎn)生大量自身抗體，導(dǎo)致全身多組織多器官受累。有研究指出，SLE的發(fā)生涉及機(jī)體過(guò)多的自身抗體，由于T、B淋巴細(xì)胞功能異?；罨l(fā)生免疫紊亂，大量免疫復(fù)合物在腎臟、關(guān)節(jié)等沉積，造成多系統(tǒng)多臟器損害[5-6]。中醫(yī)典籍對(duì)于SLE并無(wú)準(zhǔn)確記載，相關(guān)中醫(yī)文獻(xiàn)稱之為“鬼臉瘡”“日曬瘡”，臨床癥狀與SLE的蝶形紅斑、光敏感及盤狀紅斑等有相似之處。SLE病因病機(jī)可能是以素體稟賦不足、腎精虧損為本，感受外界熱毒之邪、瘀血阻滯為標(biāo)，虛實(shí)互為因果，尤其育齡女性氣火旺盛，多有陰虛內(nèi)熱，加之邪毒外襲，病久虛火灼津，陰血虧虛，故以肝腎陰虛為本，熱毒瘀血為標(biāo)[7-8]。且SLE活動(dòng)期免疫反應(yīng)亢進(jìn)，以邪盛為主，多為血熱加濕毒，緩解期免疫功能下降，多以正虛為主，辨證為肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛[9]，從而導(dǎo)致一系列多臟器受損、多器官功能障礙的臨床表現(xiàn)。

中醫(yī)學(xué)稱失眠為“不寐”?！鹅`樞·大惑論》記載：“衛(wèi)氣不得入于陰，常留于陽(yáng)，留于陽(yáng)則陽(yáng)氣滿，陽(yáng)氣盛則陽(yáng)蹺盛；不得入于陰則陰氣虛，故目不瞑矣?！盵10]傳統(tǒng)中醫(yī)理論指出，失眠是由于陽(yáng)不交陰、陰陽(yáng)失調(diào)所致。陰虛是誘發(fā)陰陽(yáng)不交的主要原因，腎為先天之本，腎陰虛是引起失眠的重要病機(jī)，而肝腎同源，故肝腎陰虛是導(dǎo)致長(zhǎng)期而頑固失眠的重要病機(jī)[11]。肝腎陰虛型失眠，多心煩易躁，伴自汗及盜汗，醒時(shí)烘熱汗出，睡中盜汗，盜汗即醒[12]。由于SLE患者病程長(zhǎng)，病情反復(fù)，生活節(jié)律被打亂，出現(xiàn)難以入睡而不得眠，醒后不易再睡，甚至徹夜不眠等失眠癥狀，推測(cè)與大腦皮層的興奮和抑制調(diào)節(jié)功能失衡有關(guān)。SLE患者隨著病情進(jìn)展多出現(xiàn)失眠，會(huì)累及臟腑，導(dǎo)致功能障礙。

本研究結(jié)果顯示，SI-LKYD-SLE組、LI-LKYD-SLE組患者PSQI、HAMA、HAMD評(píng)分均高于LKYD-SLE組（P＜0.01），尤其LI-LKYD-SLE組患者上述各項(xiàng)指標(biāo)較SI-LKYD-SLE組明顯增加（P＜0.001），提示隨失眠時(shí)間延長(zhǎng)，睡眠質(zhì)量下降，患者焦慮抑郁情緒會(huì)明顯加重。進(jìn)一步PSG監(jiān)測(cè)提示各肝腎陰虛型失眠組患者睡眠潛伏期、覺(jué)醒次數(shù)、覺(jué)醒時(shí)間發(fā)生異常，隨失眠時(shí)間延長(zhǎng)，睡眠效率明顯下降（P＜0.01）。有研究指出，失眠癥與焦慮障礙及抑郁癥的共患率較高，其焦慮障礙患者伴睡眠紊亂、驚恐障礙和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的比例竟達(dá)70%[13-14]，提示失眠與焦慮抑郁障礙可能有相似的發(fā)病機(jī)制，因此存在著高度的共病特點(diǎn)。所以，伴有失眠的肝腎陰虛型系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者在病程發(fā)展進(jìn)程中，隨著失眠時(shí)間的增加，睡眠質(zhì)量及不良情緒均會(huì)明顯加重。

研究報(bào)道，SLE相關(guān)免疫炎性因子表達(dá)的增多，與病情發(fā)展的程度相關(guān)，尤其IgG、IgA、IgM、ESR表達(dá)的增加與SLE發(fā)展嚴(yán)重程度有明確相關(guān)性，而C3、C4隨著SLE嚴(yán)重程度的增加則會(huì)減少[15-16]。本試驗(yàn)中SI-LKYD-SLE、LI-LKYD-SLE組患者IgG、IgA、IgM、ESR含量均較LKYD-SLE組患者增高（P＜0.01），而C3、C4的表達(dá)則減少。與研究結(jié)果一致，失眠發(fā)生涉及多種體內(nèi)炎性反應(yīng)因子、神經(jīng)體液多系統(tǒng)，長(zhǎng)期失眠會(huì)引起機(jī)體免疫機(jī)能紊亂及失調(diào)，提示SLE患者失眠程度與免疫功能異常存在相關(guān)。研究證實(shí)，SLE患者初期氣血虧虛，進(jìn)展至后期出現(xiàn)肝腎陰虛，機(jī)體免疫功能下降，導(dǎo)致紅細(xì)胞、白細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及補(bǔ)體等減少[17]。并且，肝腎陰虛型SLE患者發(fā)展至后期，病情相對(duì)穩(wěn)定，但體內(nèi)多種炎性因子仍存在動(dòng)態(tài)變化，隨失眠時(shí)間的不斷增加，睡眠質(zhì)量相關(guān)參數(shù)、情緒因素及各種炎性因子表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著變化，與失眠的嚴(yán)重程度存在潛在關(guān)系。

近年研究指出，Treg淋巴細(xì)胞是T細(xì)胞家族一個(gè)新亞群，能夠調(diào)控具有潛在傷害性的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，對(duì)病原體、異變細(xì)胞和機(jī)體異物具有防御、清除和識(shí)別的作用，對(duì)免疫反應(yīng)有抑制作用[18]。Treg細(xì)胞參與SLE、腫瘤和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程[19]。本試驗(yàn)顯示，Treg細(xì)胞在不同失眠程度的肝腎陰虛型SLE患者中表達(dá)是不相同的，隨失眠時(shí)間延長(zhǎng)，Treg細(xì)胞數(shù)表達(dá)會(huì)減少，且Treg細(xì)胞與TGF-β可能存在促進(jìn)作用，與IL-6、IL-10之間可能存在相互抑制的關(guān)系。其中，炎癥因子IL-6、IL-10具有調(diào)節(jié)睡眠的作用，當(dāng)睡眠結(jié)構(gòu)紊亂時(shí)，IL-6、IL-10表達(dá)會(huì)增高，失眠時(shí)間越長(zhǎng)，IL-6、IL-10表達(dá)越明顯，而IL-6是B淋巴細(xì)胞分化因子，可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，其表達(dá)增高會(huì)干擾Treg細(xì)胞功能，使CD4+T淋巴細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化減少[20]。有研究[21]指出，Treg細(xì)胞負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用是通過(guò)TGF-β抑制免疫細(xì)胞增生及Th1和Th2細(xì)胞的分化成熟，以及致炎因子IL-6、TGF-β等介導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)而實(shí)現(xiàn)的。所以，體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量變化、功能異常及細(xì)胞因子表達(dá)情況均與肝腎陰虛型SLE患者失眠程度存在一定關(guān)系。

總之，肝腎陰虛型SLE患者隨著失眠時(shí)間的增加、失眠程度的加重，睡眠結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，機(jī)體免疫紊亂程度愈加明顯，Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)愈異常。但機(jī)體免疫功能存在多種因素調(diào)節(jié)，Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子參與SLE的發(fā)病，可能還存在其它T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子參與失眠相關(guān)肝腎陰虛型SLE的發(fā)生，仍需進(jìn)一步研究。所以，肝腎陰虛型SLE患者免疫功能紊亂參與失眠發(fā)生，且失眠程度與Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子存在潛在相關(guān)。