基于HPLC-UV-ELSD指紋圖譜法同時(shí)測(cè)定絞股藍(lán)中4種成分及不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)*

王源源，丁 鵬

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

絞股藍(lán)為多年生草質(zhì)藤本植物，始載于《救荒本草》，又名七葉膽、福音草、遍地生根、天堂草、五葉參、七葉參、超人參等[1-2]。據(jù)《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第5期）記載，絞股藍(lán)來源于葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的干燥地上部分。生長于山谷密林（海拔100～3 200 m）、山坡疏林及灌叢中，在陜西、甘肅和長江以南各地廣泛分布[3]。有清熱解毒、益氣健脾、養(yǎng)陰生津、化痰止咳、養(yǎng)心安神之功效，用于治療體虛乏力、虛勞失精、白細(xì)胞減少、高脂血、病毒性肝炎、慢性胃腸炎、慢性氣管炎等病癥，也比較適合肥胖和長期疲勞的人群，近年來被冠以“南方人參”和“第二人參”的美譽(yù)[4-6]。絞股藍(lán)藥材中含有絞股藍(lán)皂苷、黃酮類、絞股藍(lán)糖苷、微量元素、維生素、礦物質(zhì)等多種化學(xué)成分，目前普遍認(rèn)為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷和黃酮是其兩大主要有效成分[7-10]?，F(xiàn)代藥理研究表明[11-13]，以絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX為代表的皂苷類成分和以蘆丁和槲皮素為代表的黃酮類成分均具有抑制腫瘤生長、降低血糖、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、減少氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血脂平衡等作用。

近年來，國內(nèi)學(xué)者主要對(duì)絞股藍(lán)藥材中黃酮類或皂苷類成分分別進(jìn)行指紋圖譜、化學(xué)成分或藥理作用的研究，但僅以其中單一成分對(duì)絞股藍(lán)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，難以體現(xiàn)中藥多成分、多靶標(biāo)協(xié)同作用的整體性，而相關(guān)研究報(bào)道鮮見?！吨腥A人民共和國藥典》（2015版）未收載絞股藍(lán)藥材相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，部分地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其質(zhì)量的全面控制還不夠完善，而藥材的質(zhì)量易受多方面因素（如品種、產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境、不同批次及不同產(chǎn)地等）的影響。故本試驗(yàn)將通過HPLC-UVELSD串聯(lián)指紋圖譜和定量分析法綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材的質(zhì)量，以期能整體上控制其質(zhì)量，為絞股藍(lán)藥材臨床使用的有效性和穩(wěn)定性提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器Agilent1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括UV檢測(cè)器，四元梯度泵，軟件Empower Pro色譜工作站；Alltech3300型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）（格雷斯中國有限公司）；Milli Pore Advantage A10型自動(dòng)純水機(jī)（美國密理博公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士梅勒特有限公司）。

1.2 試藥 對(duì)照品包括蘆丁（批號(hào)：100080-201610，純度≥91.9%）、槲皮素（批號(hào)：100081-201408，純度≥99.1%）、絞股藍(lán)皂苷A（批號(hào)：157752-01-7，純度≥98.0%）、絞股藍(lán)皂苷XLIX（批號(hào)：94987-08-3，純度≥98.0%）均購于中國食品藥品檢定研究院；流動(dòng)相乙腈和甲醇（色譜級(jí)）；蒸餾水（屈臣氏）。其余試劑為分析純。不同產(chǎn)地絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino藥材共15批均購買藥材市場(chǎng)或藥店，見表1。

表1 15批絞股藍(lán)藥材來源信息

1.3 觀察指標(biāo)與方法 觀察指標(biāo)：（1）HPLC-UV-ELSD研究絞股藍(lán)藥材指紋圖譜：研究15批不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材的共有模式；（2）測(cè)定絞股藍(lán)藥材中槲皮素、蘆丁、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XLIX 4種成分的含量。檢測(cè)方法：（1）HPLC-UV-ELSD指紋圖譜研究：色譜條件為Thermo BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.5%乙酸水（B）溶液為流動(dòng)相；梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，10%（A），10～18 min，10%→20%（A），18～40 min，20%→45%（A），40～55 min，45%→60%（A），55～70 min，60%→100%（A）；檢測(cè)波長為360 nm；柱溫為30℃；ELSD漂移管溫度為80℃，載氣流量為1.5 L/min；進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。分別精密稱取蘆丁、槲皮素、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XLIX適量對(duì)照品，置于5 mL的棕色量瓶中，緩緩滴加甲醇溶液至刻度定容溶解，制備的混合對(duì)照品溶液終濃度分別為蘆丁0.256 mg/mL、槲皮素0.131 mg/mL、絞股藍(lán)皂苷A 0.142 mg/mL、絞股藍(lán)皂苷XLIX 0.185 mg/mL。然后，稱取絞股藍(lán)藥材（過65目篩）約2.0 g，精密稱重后，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）適量，加熱回流提取至無色，冷卻，棄去石油醚液，揮干溶劑。再次加入甲醇80 mL，進(jìn)行4 h的回流提取，冷卻后加甲醇定容稀釋至100 mL，搖勻，所有樣品進(jìn)樣前需過0.45 μm的微孔濾膜。（2）含量測(cè)定：在指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上同時(shí)定量分析4種成分的含量，精密吸取各對(duì)照品母液，稀釋配制一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按已定的高效液相色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)照品峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)（X），根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出各指標(biāo)性成分的線性回歸方程。

2 結(jié) 果

2.1 HPLC-UV-ELSD指紋圖譜研究結(jié)果

2.1.1 精密度試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)中的同一供試品溶液連續(xù)6次進(jìn)樣，參照峰為4號(hào)（蘆?。┓澹謩e計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD和相對(duì)峰面積RSD。結(jié)果顯示，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，并且各共有指紋峰的相似度均大于0.990，表明高效液相色譜儀的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)中的同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，參照峰為4號(hào)（蘆?。┓澹謩e計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD和相對(duì)峰面積RSD。結(jié)果顯示，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，并且各共有指紋峰的相似度均大于0.990，表明本次實(shí)驗(yàn)制備的供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份過65目篩的絞股藍(lán)樣品（S1）2.0 g，樣品溶液按照已定的方法制備，過濾進(jìn)樣分析，參照峰為4號(hào)（蘆丁）峰，分別計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD和相對(duì)峰面積RSD。結(jié)果顯示，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，并且各共有指紋峰的相似度均大于0.990，表明本次實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 HPLC-UV-ELSD指紋圖譜的建立及其相似度分析 分別精密吸取10 μL的對(duì)照品溶液及樣品溶液，進(jìn)樣分析，記錄15批不同來源絞股藍(lán)藥材在70 min內(nèi)的HPLC-UV-ELSD串聯(lián)色譜圖。比對(duì)混合對(duì)照品色譜圖中各色譜峰的保留時(shí)間，結(jié)果指認(rèn)了峰3為槲皮素，峰4為蘆丁，峰6為絞股藍(lán)皂苷XLIX，峰8為絞股藍(lán)皂苷A。最后以AIA格式將15批絞股藍(lán)藥材的HPLC-UV-ELSD指紋色譜圖導(dǎo)入軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（A版）》中，樣品S1設(shè)為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)對(duì)照?qǐng)D譜生成法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.2，指紋共有峰的疊加圖譜分別如圖1和圖3所示，自動(dòng)生成的對(duì)照指紋圖譜分別見圖2～4，參照峰為4號(hào)（蘆?。┓?。最后確定了絞股藍(lán)樣品中有11個(gè)共有特征峰，其共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.65%、0.68%、0.73%、0.00%、0.12%、0.55%、0.31%、0.76%、0.82%、0.67%、0.93%及相對(duì)峰面積RSD分別為10.23%、12.35%、13.63%、0.00%、11.53%、9.54%、10.27%、13.29%、15.82%、13.72%、10.70%。15批的絞股藍(lán)樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果分別為0.999、0.990、0.991、0.989、0.986、0.995、0.992、0.993、0.991、0.995、0.996、0.988、0.987、0.990、0.990。

圖1 15批絞股藍(lán)藥材HPLC-UV指紋圖譜

圖2 15批絞股藍(lán)藥材HPLC-UV對(duì)照指紋圖譜

圖3 15批絞股藍(lán)藥材HPLC-ELSD對(duì)照指紋圖譜

圖4 15批絞股藍(lán)藥材HPLC-ELSD對(duì)照指紋圖譜

2.2 4 種成分的定量分析結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察 按已定的分析方法進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后分別計(jì)算得線性回歸方程為槲皮素Y1=4 502.7X1+38 912（r1=0.999 9）；蘆丁Y2=2 532.7X2+24 623（r2=0.999 8）；絞股藍(lán)皂苷AY3=6 477.7X3+47 010（r3=0.999 9）；絞股藍(lán)皂苷XLIXY4=6 482.7X4+47 720（r4=0.999 8）。結(jié)果表明，4種指標(biāo)性成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)中的同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，含量RSD分別為槲皮素1.13%、蘆丁1.25%、絞股藍(lán)皂苷A 1.05%和絞股藍(lán)皂苷XLIX 0.97%，表明本次試驗(yàn)所用的高效液相色譜儀的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。結(jié)果顯示，含量RSD分別為槲皮素0.33%、蘆丁0.49%、絞股藍(lán)皂苷A 0.72%和絞股藍(lán)皂苷XLIX 0.35%，表明試驗(yàn)制備的供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取6份過65目篩的絞股藍(lán)藥材粉末（S1）2.0 g，按照已定的樣品制備方法進(jìn)樣分析檢測(cè)。結(jié)果表明，槲皮素、蘆丁、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XLIXRSD分別為1.04%、0.55%、0.86%、1.13%，表明本次試驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取9份過65目篩的絞股藍(lán)藥材粉末（S1）樣品0.1 g，將其平均分為3組（即50%、100%、150%），按已定樣品制備方法進(jìn)行制備，根據(jù)峰面積（A）計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果顯示，4種成分的平均加樣回收率分別為槲皮素102.0%（RSD=1.27%）、蘆丁98.5%（RSD=1.15%）、絞股藍(lán)皂苷A 101.5%（RSD=0.89%）、絞股藍(lán)皂苷XLIX 100.9%（RSD=0.99%）。

2.2.6 含量測(cè)定結(jié)果 取過65目篩的15批絞股藍(lán)藥材粉末，按已定方法制備和進(jìn)樣分析，分別計(jì)算藥材中4種成分的含量，結(jié)果見表2。4種成分總含量高低順序?yàn)椋汉笔撸娟兾髌嚼娟兾髌嚼竞鄙褶r(nóng)架＞陜西龍西＞云南昆明＞安徽亳州＞安徽亳州＞云南昆明＞福建古田＞安徽亳州＞廣西桂林＞安徽亳州＞福建古田＞安徽亳州。結(jié)果表明，湖北和陜西產(chǎn)地的絞股藍(lán)藥材含量均高于4.0%，可以歸為Ⅰ類；云南、廣西、福建、安徽產(chǎn)地的絞股藍(lán)含量均低于4.0%，可以歸為Ⅱ類。

表2 15批絞股藍(lán)藥材中4種成分的含量（%，n=3）

3 討 論

3.1 提取方式考察 試驗(yàn)過程中還考察了不同提取方式對(duì)絞股藍(lán)樣品的提取效率，包括超聲波提取、索氏加熱回流提取、水浴加熱回流提取，結(jié)果顯示，索氏回流提取法所得色譜圖的色譜峰信息較豐富，故試驗(yàn)選取索氏回流提取方法；查閱文獻(xiàn)知[14-16]，絞股藍(lán)中可能含有大量的脂溶性成分，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)合黃酮類成分（槲皮素、蘆?。┖驮碥疹惓煞郑ńg股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX）的化學(xué)性質(zhì)對(duì)提取溶劑，即石油醚（60～90℃）、三氯甲烷、甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇進(jìn)行了考察，結(jié)果表明先以石油醚（60～90℃）除去干擾較大的脂溶性成分，再以甲醇為提取溶媒時(shí)色譜峰的豐度較好、基線較平穩(wěn)、雜峰較少；對(duì)索氏回流提取時(shí)間，即提取1、2、4、6、8 h進(jìn)行考察，結(jié)果顯示索氏回流提取4 h即可提取完全。

3.2 色譜條件確定 本次實(shí)驗(yàn)通過全波長掃描（190～400 nm），最終選取最大吸光度360 nm作為本次實(shí)驗(yàn)的紫外檢測(cè)波長；通過考察Agilent TC-C18、Thermo BDS C18和Agilent SB C18不同型號(hào)及不同廠家色譜柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.5%乙酸水溶液、乙腈-0.5%乙酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-水溶液不同流動(dòng)相系統(tǒng)，25℃、30℃和40℃不同色譜柱柱溫，0.8、1.0和1.2 mL/min不同流速，60℃、70℃和80℃不同漂移管溫度。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選取Thermo BDS C18柱為本次實(shí)驗(yàn)的色譜柱、乙腈-0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相、流速為1.0 mL/min、柱溫為30℃、80℃的漂移管溫度，在此條件下樣品具有較豐富的色譜信息、平穩(wěn)的基線、較高的豐度、較少的雜峰、平滑對(duì)稱的峰形及較好的分離度。

3.3 小結(jié) 本次試驗(yàn)評(píng)價(jià)了15批不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材的質(zhì)量，結(jié)果建立了不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材的HPLC-UV-ELSD指紋圖譜，鑒定了共有特征峰11個(gè)，通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了其中4個(gè)成分。在指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，同時(shí)定量分析了4個(gè)指標(biāo)性成分的含量。由定量分析結(jié)果可知，不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材中槲皮素、蘆丁、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷XLIX的含量參差不齊，整體來看，不同產(chǎn)地絞股藍(lán)樣品中4種成分含量從高到低分別為：蘆丁、絞股藍(lán)皂苷A、絞股藍(lán)皂苷XLIX和槲皮素。其中蘆丁的平均含量約是槲皮素平均含量的10倍，差異較明顯；黃酮類成分的總量是皂苷類成分的1.2倍，兩大類成分總含量整體上相差不大。從產(chǎn)地上看，陜西和湖北產(chǎn)的絞股藍(lán)藥材質(zhì)量較優(yōu)，其他產(chǎn)地次之。本次試驗(yàn)建立的HPLC-UVELSD指紋圖譜與多指標(biāo)性成分定量分析方法簡(jiǎn)單、可靠，可作為絞股藍(lán)藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)的方法之一，同時(shí)也為下一步建立完善的絞股藍(lán)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。