HPLC法同時測定烏藥湯配方顆粒中4種成分的含量*

王瑞穎，易 柳，李 珊，高元峰，歐陽榮

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

烏藥湯，最早出自于《蘭室秘藏》（金·李東垣）[1]。方中烏藥，散寒行氣止痛，為君藥；香附疏肝理氣，調(diào)經(jīng)止痛，加強(qiáng)烏藥的治療作用，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，使行氣活血而不傷血，共為臣藥；木香行氣止痛而消脹，為佐藥；甘草緩急止痛，兼調(diào)諸藥，為使藥。諸藥相合，共奏行氣活血、調(diào)經(jīng)止痛之功，使氣行血暢，調(diào)經(jīng)止痛[2-3]。該方2018年被收錄于國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》。盡管烏藥湯臨床使用歷史悠久，但有關(guān)烏藥湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制方面的研究甚少。當(dāng)前，烏藥湯配方顆粒無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，既不利于產(chǎn)品質(zhì)量一致性的評價，也不利于產(chǎn)品更進(jìn)一步的機(jī)理研究[4-5]。本實驗采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷、甘草酸單銨鹽4個指標(biāo)成分的含量，以期更好地控制烏藥湯配方顆粒的質(zhì)量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器Agilent1260高效液相色譜儀（含1260 Vialsamper，1260 Quat Pump，1260 MCT，1260 DAD WR，美國安捷倫公司）；LC1260安捷倫工作站；5424R高速低溫離心機(jī)（美國Eppendrof公司）；AE2204高精度分析電子天平（湖南湘儀公司）；DYQC-30醫(yī)用超聲波清洗儀（連云港歐倍潔醫(yī)療設(shè)備有限公司）；XH-D振蕩器（浙江天儀公司）。

1.2 試藥 分析純甲醇（含量99.9%，湖南匯虹試劑）；乙腈（色譜級，含量99.9%，美國Tedia公司）；甲醇（色譜級，含量99.9%，美國Tedia公司）；磷酸（色譜級，含量98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三蒸水（醫(yī)院自制純化水）。對照品：去甲異波爾定（批號：wkq19013101，四川維克奇）、阿魏酸（批號：wkq19030705，四川維克奇）、甘草苷（批號：DST200412-009，德思特生物）、甘草酸單銨鹽（批號：wkq19041108，四川維克奇）。烏藥湯配方顆粒，組方中的5味藥均來自江陰天江藥業(yè)有限公司，包括烏藥配方顆粒（批號：1811123，1911124和2011125）、當(dāng)歸配方顆粒（批號：1801115，1901114和2001116）、木香配方顆粒（批號：1805123，1905124和2005119）、香附配方顆粒（批號：1810114，1910110和2010115）、甘草配方顆粒（批號：1810154，1910152和2010201）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.5%磷酸，梯度洗脫；柱溫：30℃；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液配制 分別精密稱取去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽對照品適量，置于10 mL定量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，分別得到280、250、1 300、1 400 mg/L對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 供試品溶液配制 按組方比例精密稱取烏藥湯配方顆粒共0.058 g，混勻，加入50%甲醇定容至1 mL，振蕩，超聲30 min，12 000 r/min離心10 min。取200 μL于1.5 mL離心管中，加入600 μL 50%甲醇，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 專屬性試驗 在“2.1”項色譜條件下，去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽保留時間分別為8.8、22.2、22.9、40.6 min，分離度良好，無其他成分干擾。（見圖1）

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取“2.2”項下4種對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別按比例稀釋，制備6種不同濃度的對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下，進(jìn)樣20 μL測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，從中可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.6 精密度試驗“2.2”項下對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，在“2.1”項色譜條件下，進(jìn)樣20 μL測定，測得去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽峰面積RSD分別為0.05%、0.27%、0.11%、0.06%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取3份烏藥湯配方顆粒，按“2.3”項下方法制備3種不同濃度的供試品溶液，室溫下于0、1、2、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下測定，測得去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽峰面積RSD分別為0.32%、1.21%、0.21%和0.42%，表明這些溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取烏藥湯配方顆粒，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣20 μL測定，測得去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽含有量RSD分別為0.58%、1.83%、0.45%、2.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 試驗取已知含有量的烏藥湯配方顆粒，加入適量對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項色譜條件下測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.10 樣品含量測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算樣品中去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽的含有量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg/L，n=3）

3 討 論

烏藥湯具有疏肝解郁、行氣活血、調(diào)經(jīng)止痛功效，常用于治婦人血海疼痛，其療效切確，臨床上使用的歷史悠久[6]。古代醫(yī)書多有記載烏藥湯的情況，其中《蘭室秘藏》云：“烏藥湯，治婦人血海疼痛?！盵1，7]《素問·痿論篇》云：“陽氣內(nèi)動，發(fā)則心下崩、數(shù)溲血”[8]?！秲?nèi)科概要》云：“經(jīng)前及經(jīng)行腹痛，屬瘀血挾逆氣內(nèi)阻。”《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》說：“經(jīng)前腹脹痛，乃血氣凝滯。若脹過于痛，是氣滯其血也，宜用加味烏藥湯開之?！盵9]從上述古典籍可以看出，自元代起便有用烏藥湯緩解痛經(jīng)，并延續(xù)至今?，F(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，從烏藥湯中能篩選出菜薊苦素、金圣草（黃）素、甘草素等活性成分，這些成分能影響內(nèi)分泌抵抗、雌激素受體信號傳導(dǎo)通路和催乳激素信號通路。此外，烏藥湯亦可為基礎(chǔ)方，通過加味，治療幽門螺桿菌陰性胃潰瘍[10]、坐骨神經(jīng)痛[11]、潰瘍性結(jié)腸炎[12]、糖尿病胃輕癱綜合治療[13]、小兒腸痙攣[14]、肝郁氣滯型功能性消化不良[15]等疾病。本研究建立同時測定去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽含量的HPLC法，以期為烏藥湯配方顆粒提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 提取方法的選擇 實驗前期，提取劑考察中比較了甲醇、乙醚、正己烷、石油醚、50%甲醇和純水的提取效果。其中，甲醇、乙醚提取液，溶劑峰過高、出峰少、峰型不好；正己烷、石油醚提取后雜質(zhì)成分較多，分離度不高；而50%甲醇出峰數(shù)量合理，且能匹配出本實驗測定的4種成分。提取時間和溫度也分別進(jìn)行了考查，對回流提取和超聲提取兩種方式進(jìn)行了對比，差異不大，考慮操作方便快捷，最終選擇50%甲醇30℃超聲提取30 min，此方法提取效率高，溶劑峰影響小。

3.2 色譜柱及波長的選擇 因供試品成分復(fù)雜，極性與非極性物質(zhì)較多，筆者曾對Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent 5 HC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent 5 TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同的色譜柱進(jìn)行考察，對比后發(fā)現(xiàn)其中Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），出峰時間合適，分離度較好且峰形優(yōu)良。此外，筆者也進(jìn)行190～360 nm全波長范圍掃描，分別記錄了去甲異波爾定、阿魏酸、甘草苷和甘草酸單銨鹽的光譜吸收情況，最終確定檢測波長為280 nm。

3.3 流動相的選擇 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸和乙腈-0.05%磷酸等流動相體系。其中，甲醇-水體系，保留時間過長，檢測效率低，且常出現(xiàn)基線上移的現(xiàn)象；乙腈-水體系，色譜峰出現(xiàn)分叉；最終選擇乙腈-0.05%磷酸體系，其分離效果較好，出峰穩(wěn)定、峰型尖銳。