六和湯對脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠的保護作用*

李小梅，鹿 偉，杜錦輝

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

胃潰瘍是一種臨床常見的胃黏膜功能受損、胃組織病理出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的多發(fā)性消化系統(tǒng)疾病。胃潰瘍可發(fā)生潰瘍出血、幽口梗阻、貧血及潰瘍穿孔等多種并發(fā)癥，嚴重危害人類健康[1-2]。目前，臨床常用殺菌、抑酸及保護胃黏膜等西藥治療胃潰瘍，但治療效果不佳，復(fù)發(fā)率高，長期服用甚至出現(xiàn)耐藥性，因此胃潰瘍的治療仍是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一大問題[3-4]。

中醫(yī)學(xué)認為胃潰瘍是由于正氣虛弱、脾胃功能不足、脾胃自虛而引發(fā)的胃脘痛，而脾胃虛寒被認為是在各種胃潰瘍類型中最為常見和高發(fā)的一種類型[5]。脾胃虛寒型胃潰瘍主要病機為脾胃虛弱為本，瘀熱內(nèi)阻為標，實乃本虛標實、氣血逆亂瘀滯之證，故中醫(yī)常以行氣活血，溫中散寒治療[6]?！短交菝窈蛣┚址健酚杏涊d“六和湯治心脾不調(diào)，氣不升降，寒熱交作，并傷寒陰陽不分，冒暑伏熱煩悶，或成痢疾，并宜服之”。由此可見六和湯有健脾祛濕、升清降濁之功效[7-8]。因此，本研究通過動物實驗，探討了六和湯對脾胃虛寒型胃潰瘍的保護作用及可能的作用機制，以期為胃潰瘍的治療提供新方法和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康狀況良好的SPF級SD雄性大鼠52只，4周齡，體質(zhì)量80～100 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2016-0002。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，溫度為18～25℃，相對濕度為40%～60%，自由飲水飲食，所有大鼠均采用斷頸法進行處死，本實驗經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 番瀉葉購于北京同仁堂藥店（批號：180104002），番瀉葉水煎劑制備方法為1 g番瀉葉加入5 mL去離子水文火熬煮30 min，過濾藥液，同樣方法熬煮3次后合并藥液，4℃保存?zhèn)溆谩Ａ蜏幬锝M成：白術(shù)15 g，茯苓15 g，人參10 g，半夏10 g，三七10 g，杏仁10 g，木瓜6 g，砂仁6 g，黃連6 g，木香6 g，甘草6 g。上述藥材加10倍量水煎煮40 min，過濾后在藥渣中加入8倍量水繼續(xù)煎煮30 min后，過濾，將文火熬煮2次后的藥液合并，兌入適宜的食用糖，并加熱直至糖融化，4℃保存?zhèn)溆?。阿司匹林腸溶片（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，批號：018150593）研磨后溶于去離子水中制成混合液，灌胃劑量為200 mg/kg。IL-6酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）試劑盒（貨號：K4145-100）、TNF-α酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）試劑盒（貨號：K1052-100）（美國Biovision公司）；MDA試劑盒（貨號：A003-1）、SOD試劑盒（貨號：A001-1-1）（南京建成工程研究所）；p-p38 MAPK兔抗鼠單克隆抗體（貨號：9216S）、p-JNK兔抗鼠單克隆抗體（貨號：9255S）（美國Cell Signaling Technology公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：A0208）。

1.3 主要儀器MNT-150T型游標卡尺（德國美耐特公司）；Cytation3型酶標儀（美國BIOTEK公司）；Leica EG1150型組織包埋機（德國徠卡公司）；RM2235型組織切片機（德國徠卡公司）；PowerPac型電泳儀（美國BIO Rad公司）；1703940型轉(zhuǎn)膜儀（美國BIO Rad公司）。

1.4 造模與分組52只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機取13只大鼠作為正常對照組，其余39只大鼠，采用苦寒瀉下和游泳力竭法建立脾胃虛寒型大鼠模型[5]，用番瀉葉水煎液（1 g/mL）對造模大鼠進行灌胃，2 h后將各組大鼠放入裝有常溫自來水的50 cm深的水槽中游泳，使其整體沒入水中3 s后立即撈起，連續(xù)7 d建立脾胃虛寒模型。第8天起對各組大鼠灌胃給予無水乙醇，1 h后再次灌胃給予阿司匹林（0.2 g/kg），連續(xù)5 d，建立脾胃虛寒胃潰瘍大鼠模型，造模期間大鼠共死亡6只，隨機取正常對照組及造模組大鼠各3只，病理切片結(jié)果顯示造模組大鼠胃黏膜組織出現(xiàn)胃黏膜結(jié)構(gòu)受損，皺皮增厚，出現(xiàn)潰瘍、上皮細胞脫落及大量炎癥細胞浸潤的情況，則判斷造模成功。造模成功后，將存活的30只模型大鼠隨機分為模型組、六和湯高劑量組和六和湯低劑量組，每組10只。

1.5實驗給藥 灌胃方式給藥，六和湯方中總生藥量為100 g，根據(jù)人與大鼠體表面積計算公式得出大鼠每日生藥量=總生藥量/成人體質(zhì)量（60 kg）×6.3，六和湯高、低劑量組大鼠分別灌胃給予六和湯42、10.50 g/kg，正常對照組和模型組灌胃等量冷開水，1次/d，連續(xù)14 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般癥狀和體征 實驗期間，每天09:00:00定時觀察各組大鼠一般情況（如活動狀態(tài)、大便及毛發(fā)光澤度等情況），每周記錄大鼠體質(zhì)量、進食和飲水情況并檢測肛溫。

1.6.2 胃黏膜潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率測定 電子數(shù)顯游標卡尺測量各組大鼠胃黏膜潰瘍和糜爛部分，并采用Guth法計算其潰瘍指數(shù)和抑制率[9]。潰瘍抑制率（%）=[（模型組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù)）/模型組潰瘍指數(shù)]×100%。（見表1）

表1 潰瘍指數(shù)評分標準

1.6.3 大鼠血清中炎癥因子（IL-6、TNF-α）和氧化應(yīng)激指標（MDA、SOD）的檢測 給藥結(jié)束后，麻醉各組大鼠，腹主動脈采血，在4℃離心條件下，12 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80℃保存?zhèn)溆谩栏癜凑赵噭┖姓f明書對血清中炎癥因子和氧化應(yīng)激指標進行檢測。

1.6.4 大鼠胃黏膜組織病理切片 取出大鼠胃組織，生理鹽水漂洗、濾紙吸干，轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛溶液浸泡固定48 h，脫水、包埋、切片、HE染色，鏡下觀察大鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6.5 Western blotting法檢測胃組織MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達 常規(guī)方法提取胃組織蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入β-actin一抗（1∶1 000）、p-JNK一抗（1∶1 000）、p-p38 MAPK一抗（1∶1 000），37℃，搖床搖勻4 h，1×TBST洗滌3次后加入HRP標記羊抗兔二抗（1:5 000），室溫孵育1 h，1×TBST洗滌3次，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，得到p-p38 MAPK、p-JNK條帶，根據(jù)條帶的灰度值計算蛋白表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料采用（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，方差齊采用SNK-q檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 正常對照組大鼠動作反應(yīng)靈敏，大便正常，體質(zhì)量正常。與正常對照組比較，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，易扎堆聚集，大便較稀，體質(zhì)量下降，肛溫下降（P＜0.05）；與模型組比較，六和湯高、低劑量組大鼠便稀、扎堆聚集狀況得到緩解，體質(zhì)量和肛溫明顯增加（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠肛溫明顯升高（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠體質(zhì)量及肛溫變化（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量及肛溫變化（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與六和湯低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg） 體質(zhì)量（g） 肛溫（℃）正常對照組 10 - 288.54±14.87 37.99±0.07模型組 10 - 232.33±13.71a 36.50±0.18a六和湯高劑量組 10 42.00 266.17±8.70b 37.55±0.16bc六和湯低劑量組 10 10.50 256.79±9.49b 37.30±0.15b

2.2 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較 模型組大鼠潰瘍指數(shù)明顯高于正常對照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠潰瘍指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠胃潰瘍指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。六和湯高劑量組潰瘍抑制率為71.62%，六和湯低劑量組潰瘍抑制率為61.99%，提示六和湯對胃潰瘍具有良好的抑制作用，高劑量的六和湯治療效果優(yōu)于低劑量六和湯。（見表3）

表3 各組大鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率

2.3 各組大鼠胃黏膜組織病理變化 正常對照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，無上皮細胞脫落、潰瘍和炎癥細胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)潰瘍、上皮細胞脫落及大量炎癥細胞浸潤的情況；六和湯高劑量組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，炎癥細胞浸潤和細胞脫落情況得到顯著改善，六和湯低劑量組大鼠炎癥細胞浸潤得到改善，但大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)存在一定的缺損，上皮細胞部分脫落。（見圖1）

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理變化（HE，×100）

2.4 各組大鼠血清炎癥因子含量比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯高于正常對照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯低于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠血清TNF-α明顯降低（P＜0.05）。提示六和湯可降低炎癥水平，高劑量六和湯效果更好。（見圖2）

圖2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量比較（±s，n=10）

2.5 各組大鼠血清MDA、SOD含量比較 模型組大鼠血清MDA含量明顯高于正常對照組，而SOD含量明顯低于正常對照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠血清MDA含量明顯低于模型組，而SOD含量高于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠血清MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高（P＜0.05）。提示六和湯可降低氧化應(yīng)激水平，高劑量六和湯效果更好。（見圖3）

圖3 各組大鼠血清MDA、SOD含量比較（±s，n=10）

2.6 各組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達情況比較 模型組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達明顯高于正常對照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。提示六和湯可抑制MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達，高劑量六和湯效果更好。（見圖4）

圖4 各組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達情況比較（±s，n=10）

3 討 論

胃潰瘍患者常見的臨床癥狀為胃部疼痛或不適、胃脹和胃酸等，若治療不及時可引發(fā)胃穿孔等而威脅患者生命。中醫(yī)把胃部綿綿作痛或絞痛或者脹氣痛歸屬“胃脘痛”的范疇。胃脘痛和人體自身的正氣有關(guān)，寒邪犯胃或熱邪犯胃都可以導(dǎo)致胃脘痛。六和湯中白術(shù)、茯苓、人參和甘草為四君子湯，有健脾益氣之功效；半夏和杏仁味辛，有燥濕理脾的作用；木瓜與黃連起到溫清除濕的效果；砂仁、木瓜及木香可起抑肝和胃、行氣化濕、舒暢氣機之功效；三七粉具有活血止痛、祛除血分瘀滯的作用。諸藥合用，共奏健脾治本、除濕理氣、行血之功[10]。

本研究中脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠反應(yīng)遲鈍，扎堆聚集，大便較稀，體質(zhì)量下降，肛溫下降。六和湯干預(yù)后，六和湯高、低劑量組大鼠便稀、扎堆聚集狀況得到緩解，體質(zhì)量和肛溫明顯增加，且潰瘍指數(shù)均低于模型組大鼠，六和湯高劑量組潰瘍抑制率達到71.62%，六和湯低劑量組潰瘍抑制率為61.99%。胃黏膜組織病理學(xué)檢查顯示，模型組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)潰瘍、上皮細胞脫落及大量炎癥細胞浸潤的情況；六和湯高劑量組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，炎癥細胞浸潤和細胞脫落情況得到顯著改善；六和湯低劑量組大鼠炎癥細胞浸潤得到改善，部分上皮細胞脫落。與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠肛溫明顯升高、潰瘍指數(shù)明顯降低。上述研究結(jié)果提示六和湯對胃黏膜有一定的保護作用，對胃潰瘍有良好的抑制作用，高劑量六和湯的治療效果優(yōu)于低劑量六和湯。另外，病理結(jié)果提示，炎癥可能參與了胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展。

胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展與胃黏膜侵襲因素和防御機理之間平衡密切相關(guān)。胃黏膜損傷修復(fù)過程涉及多種細胞因子和細胞外基質(zhì)等[11]，其中炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激是引起胃潰瘍發(fā)生的重要因素[12-13]。IL-6為誘發(fā)炎癥細胞和免疫細胞生長和分化的趨化因子，可招募大量的炎癥細胞，增加炎癥因子水平[14]。TNF-α為單核細胞分泌，是機體損傷時早期出現(xiàn)的炎癥因子[15]。IL-6和TNF-α在胃潰瘍的發(fā)病機制和治療中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[16]。血清MDA是氧化損傷產(chǎn)物，SOD是機體重要的抗氧化酶，MDA和SOD的檢測可準確反映機體的氧化應(yīng)激情況，SOD含量越高，MDA含量越低，提示潰瘍程度越輕[17]。大量的人群流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗均顯示，炎癥因子（IL-6、TNF-α）和氧化應(yīng)激相關(guān)指標（MDA、SOD）水平與胃潰瘍發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18-20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠IL-6、TNF-α、MDA含量明顯增加，SOD含量明顯降低。六和湯干預(yù)后，與模型組比較，六和湯高、低劑量組大鼠IL-6、TNF-α、MDA含量明顯降低，SOD含量明顯增加；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠血清TNF-α、MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高，說明六和湯能夠降低脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)和氧化損傷，對脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠起到保護作用，高劑量六和湯對改善脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)和氧化損傷效果更好。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一組結(jié)構(gòu)內(nèi)包含p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶及細胞外調(diào)控結(jié)構(gòu)的蛋白激酶家族。p38 MAPK信號通路可被不良刺激如活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS）激活并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[21]。DIAO S L等[22]在探討藏紅花對動脈粥樣硬化大鼠的影響發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化大鼠血清SOD水平降低，MDA、IL-6、TNF-α水平，以及p38 MAPK的磷酸化水平明顯升高，且炎癥因子水平與p-p38 MAPK密切相關(guān)，而藏紅花能減輕動脈粥樣硬化大鼠血脂異常的作用機制可能與其抗氧化、下調(diào)p-p38 MAPK和抗炎作用有關(guān)。另有研究也發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥反應(yīng)與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能是治療動脈粥樣硬化的潛在干預(yù)靶點[23]。鞏子漢等[24]發(fā)現(xiàn)白及多糖可下調(diào)JNK及p38 MAPK，抑制TNF-α、IL-6異常分泌從而對胃黏膜發(fā)揮保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達水平明顯高于正常對照組，六和湯高、低劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達水平明顯低于模型組；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達明顯降低。由此可見，MAPK信號通路參與了脾胃虛寒型胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展，六和湯可通過調(diào)控MAPK信號通路對其發(fā)揮保護作用，且高劑量六和湯效果更好。

綜上，六和湯能夠降低脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠起到保護作用，其機制可能與抑制MAPK信號通路有關(guān)，且高劑量六和湯效果更好。