銀杏內酯注射液對大鼠腦中風恢復期的改善及對神經元自噬的影響*

李偉藝，劉紅松，高山瑛，蘇志強

（漢中市人民醫(yī)院，陜西 漢中 723000）

腦中風是由腦部血液循環(huán)障礙導致局部神經功能缺失為主要特征的疾病，具有致殘率高、致死率高和患病率高的特點[1]。隨著國家經濟的發(fā)展，人民生活水平顯著提高，飲食結構發(fā)生了很大變化，致使糖尿病、高血壓、冠心病等人群增加，從而使中風發(fā)病率大幅增加[2]。銀杏內酯注射液主要成分為白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C等，有活血化瘀，通經活絡的功能，主要用于急性期和恢復期腦卒中[3]。近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)銀杏內酯對急性腦梗死及動脈粥樣硬化腦梗死患者神經功能均有改善的作用，但其對神經元自噬的影響研究尚少[4]。本研究通過建立腦中風大鼠模型，觀察銀杏內酯注射液對腦中風大鼠恢復期的改善作用，并探究其對神經元自噬的影響，以期為臨床治療腦中風提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SD雄性大鼠100只，體質量180～200 g，8周齡，清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0003。所有大鼠實驗前于室溫23～25℃，濕度60%～65%，人工12 h晝/夜循環(huán)照明，常規(guī)飼養(yǎng)。實驗操作均通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑與儀器 銀杏內酯注射液（成都百裕制藥股份有限公司，批號：08150802，規(guī)格：每盒5支，每支2 mL，含萜類內酯10 mg），奧拉西坦注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號：160518B，規(guī)格：每盒6支，每支5mL：1.0g），鼠抗神經元特異性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）單克隆抗體（美國Chemicon公司），免疫熒光標記的羊抗鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），兔抗大鼠Beclin-1、P62、微管相關蛋白1輕鏈3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）單克隆抗體（美國Chemicon公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（美國Thermo Fisher公司），TYU-20C正置型熒光顯微鏡（上海豫光儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組100只大鼠隨機取80只，采用大腦中動脈栓塞法[5]建立腦中風大鼠模型：術前大鼠禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg腹腔注射進行麻醉，仰臥固定后，左側頸部備皮正中切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。夾閉頸內動脈及頸總動脈，結扎頸外動脈近心端，在頸外動脈上切一小口自頸內動脈向顱內插入線栓，深度18～20 mm出現(xiàn)阻力時停止插入，固定線栓，結扎切口，松開頸總動脈，逐層縫合皮膚。大鼠清醒后，采用Longa評分法[6]對其進行神經功能缺損評分，評分2～3分為造模成功。評分標準：無神經功能缺損為0分；輕度神經功能缺損（右前肢無法完全伸展）為1分；中度神經功能缺損（行走時向右側旋轉）為2分；重度神經功能缺損（行走時向右側傾斜）為3分；不能自發(fā)行走，有意識障礙為4分。將造模成功的73只大鼠隨機分為模型組18只、低劑量組18只、高劑量組18只、陽性對照組19只，其余20只為假手術組，手術方法同上，但不插線栓。

1.2.2 干預方法 造模2 h后進行干預，銀杏內酯注射液和奧拉西坦注射液使用前在250 mL無菌生理鹽水中稀釋，低劑量組腹腔注射1.25 mg/kg銀杏內酯注射液，高劑量組腹腔注射2.5 mg/kg銀杏內酯注射液，陽性對照組腹腔注射50 mg/kg奧拉西坦注射液，假手術組和模型組腹腔注射無菌生理鹽水，共干預14 d。

1.2.3 神經功能評估 各組大鼠干預結束2 d后進行神經功能評估，評分方法同“1.2.1”。

1.2.4 爬桿實驗進行運動功能評估 神經功能評估結束后進行爬桿實驗，正式測試前2 d，進行預實驗，3次/d。將大鼠放在光滑金屬管頂部，頭向下，使其爬向管底。整個過程用攝像機記錄，全部拍攝完，回放錄像，按照評分標準計分，每只大鼠爬桿2次，最終計算平均分。爬桿實驗評分標準：四肢并用，一次順利從桿上爬下為0分；一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行為為0.5分；上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下，但可抱緊金屬桿為1分；滑行后掉落為1.5分；不能抓桿，直接掉落為2分。

1.2.5 腦梗死體積評估 爬桿實驗結束后，各組隨機處死4只大鼠，斷頭取腦，取出小腦和嗅球，用濾紙擦干表面血跡，置于-20℃冰箱10 min后取出，連續(xù)切6個冠狀切片，厚度約2 mm，將切片浸入1% TTC染色液中，37℃恒溫避光孵育15 min，使腦片均勻著色。經TTC染色后，正常腦組織顯示紅色，梗死區(qū)域顯示白色，每一腦片梗死面積乘以2 mm厚度得到一片腦片梗死體積，再將各腦片數(shù)值相加后得到梗死總體積，梗死體積百分比=（梗死總體積/腦部總體積）×100%。

1.2.6 NeuN免疫熒光法檢測大腦皮層神經元缺失情況 各組隨機處死5只大鼠，取出大腦，在10%甲醛溶液浸泡12 h后，20%和30%蔗糖梯度脫水，直至大腦沉底，放4℃保存?zhèn)溆?。取?℃保存的大腦，在大腦皮質頂葉區(qū)域進行冠狀切片，切片厚度25 μm，將腦切片均勻鋪在載玻片上后，-20℃保存?zhèn)溆谩δX切片進行免疫熒光實驗，滴加山羊血清封閉液孵育10 min，加入鼠抗NeuN單克隆抗體（1∶1 000）于4℃孵育過夜，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次，加入羊抗鼠IgG抗體（1∶4000），室溫避光孵育1h，0.01mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次，中性樹膠封片，熒光顯微鏡觀察。每張切片選取4個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對NeuN陽性細胞進行計數(shù)。

1.2.7 TUNEL染色觀察神經細胞凋亡 剩余大鼠全部處死，取腦，分離大腦皮層（各4只）進行切片脫蠟，其余大鼠大腦皮層-80℃保存。0.3% H2O2浸泡5 min，PBS清洗2次，5 min/次；蛋白酶K 37℃，30 min，PBS清洗3次，5 min/次；TUNEL反應液37℃，60 min，PBS清洗3次，5 min/次；3% BSA，20 min，PBS清洗3次，5 min/次；POD轉換液37℃濕盒，30 min，PBS清洗5 min；DAB顯色5 min，蘇木素復染，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察大腦皮層神經細胞凋亡情況。每張切片選取4個視野，計算凋亡率，凋亡率=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.2.8 Western Blotting檢測大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平 取出-80℃保存的大腦皮層，置于液氮中，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心取上清用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，95℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后分別加入1∶1 000稀釋的Beclin-1、P62、LC3單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入1∶4 000辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影，采用ImageJ軟件分析圖像，以β-actin為內參，Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 模型組、低劑量組、高劑量組、陽性對照組大鼠神經功能缺損評分分別為（2.96±0.29）分、（1.77±0.21）分、（1.52±0.17）分、（1.31±0.16）分，神經功能缺損評分組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=56.534，P＜0.001）。與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠神經功能缺損評分下降（t=14.101，18.174，21.584，P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠神經功能缺損評分下降（t=3.926，7.520，P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠神經功能缺損評分下降（t=3.871，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠運動功能評分比較 模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠運動功能評分分別為（1.56±0.17）分、（1.23±0.13）分、（0.84±0.09）分、（0.51±0.06）分，運動功能評分組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=45.451，P＜0.001）。與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠運動功能評分下降（t=6.542，15.881，25.326，P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠運動功能評分下降（t=10.465，21.825，P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠運動功能評分下降（t=13.190，P＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦梗死體積百分比比較 模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比分別為（28.73±2.92）%、（21.13±2.23）%、（16.14±1.65）%、（10.94±1.12）%，腦梗死體積百分比組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=87.845，P＜0.001）。與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比下降（t=4.137，7.508，11.377，P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比下降（t=3.598，8.167，P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠腦梗死體積百分比下降（t=5.215，P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠腦梗死體積

2.4 各組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量比較NeuN陽性細胞數(shù)量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量減少（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量增多（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量增多（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量增多（P＜0.05）。（見表1、圖2）

圖2 各組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量比較（×400）

表1 各組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量（±s）

表1 各組大鼠NeuN陽性細胞數(shù)量（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)NeuN陽性細胞數(shù)量(個)假手術組 5 - 274.57±19.54模型組 5 - 61.73±7.56a低劑量組 5 1.25 87.72±9.43ab高劑量組 5 2.50 128.86±13.58abc陽性對照組 5 50.00 198.76±20.23abcd F 25.768 P＜0.001

2.5 各組大鼠大腦皮層神經細胞凋亡情況 神經細胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠神經細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠神經細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠神經細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠神經細胞凋亡率降低（P＜0.05）。（見表2、圖3）

圖3 各組大鼠大腦皮層神經細胞凋亡情況（×400）

表2 各組大鼠大腦皮層神經細胞凋亡情況（±s）

表2 各組大鼠大腦皮層神經細胞凋亡情況（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)神經細胞凋亡率(%)假手術組 4 - 1.46±0.21模型組 4 - 78.45±8.31a低劑量組 4 1.25 43.62±5.38ab高劑量組 4 2.50 24.36±3.24abc陽性對照組 4 50.00 11.53±2.58abcd F 142.632 P＜0.001

2.6 各組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平比較 大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平升高，P62蛋白相對表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平降低，P62蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平降低，P62蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；陽性對照組和高劑量組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表3、圖4）

表3 各組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平（±s）

表3 各組大鼠大腦皮層Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)只 給藥劑量()(mg/kg)Beclin-1 P62 LC3-Ⅱ假手術組 5 -模型組 5 -低劑量組 5 1.25高劑量組 5 2.50陽性對照組5 50.00 F 25.744 20.346 18.736 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.43±0.05 1.46±0.16a 1.20±0.13ab 0.99±0.11abc 0.97±0.09abc 1.01±0.13 0.21±0.02a 0.49±0.05ab 0.75±0.08abc 0.78±0.08abc 0.81±0.09 1.47±0.15a 1.25±0.13ab 0.97±0.10abc 0.99±0.11abc

圖4 各組Beclin-1、P62和LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平

3 討 論

腦中風是一種突發(fā)性腦血管疾病，發(fā)病時，腦動脈阻塞，導致大腦局部供血不足，從而使該區(qū)域腦組織受損，引起神經功能障礙[7-8]。目前，由于各種條件限制，多數(shù)患者不能在中風后關鍵3 h內接受治療，而是在急性期進行非手術治療，在損傷后期依靠神經營養(yǎng)和神經修復。因此，找到理想的恢復期治療藥物成為腦中風研究的關鍵。銀杏是一種具有藥用價值的植物。研究表明，銀杏內酯注射液及其有效組分可以改善大腦中動脈阻塞模型大鼠急性缺血性腦損傷[9]。奧拉西坦是新型吡咯烷酮類藥物，可以促進腦代謝，提高大腦對葡萄糖、氧的利用能力，從而促進神經細胞功能恢復，改善機體和精神行為有關的腦整合機制，在腦中風的治療中已較為成熟[10]。因此，本研究以奧拉西坦為陽性對照，給予腦中風模型大鼠銀杏內酯注射液，觀察銀杏內酯注射液對腦中風大鼠恢復期的改善作用，旨在為中風恢復期治療提供新的思路。

銀杏內酯注射液主要成分為白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C等，白果內酯能維持血管內皮完整性，促進血管內皮增生；銀杏內酯A可緩解焦慮、改善心肌缺血、恢復膽堿能損傷記憶功能；銀杏內酯B是血小板活化因子拮抗劑，具有抗氧化、延緩衰老、保護受損傷神經元的功能；銀杏內酯C可以輔助治療心、腦血管疾病[11]。研究表明，銀杏內酯可以通過降低血腦屏障滲透性、改善腦代謝紊亂、促進良性自噬、抑制神經元凋亡等方面發(fā)揮神經保護作用[12]。張佳潔等[13]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內酯注射液治療急性腦梗死有利于改善血液流變學指標、有效調節(jié)血清血管內皮生長因子、血管生成素-Ⅱ和膠質纖維酸性蛋白含量，改善神經功能，效果顯著。吳勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內酯注射液輔助治療老年缺血性腦卒中能有效減輕患者神經功能缺損程度，提高患者生活能力。本研究中銀杏內酯注射液治療腦中風大鼠后，大鼠神經功能缺損評分、運動功能評分、腦梗死體積百分比和神經細胞凋亡率明顯降低，NeuN陽性細胞增多，對腦中風大鼠恢復期的改善作用明顯。

自噬是真核細胞中廣泛存在的溶酶體依賴降解途徑，是細胞自我保護的重要機制，在維持細胞存活、更新、胞內組分再利用和內部環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[15-16]。Beclin-1是哺乳動物細胞酵母自噬相關基因Atg6的同源基因，其上調提示自噬被激活；LC3是Atg8的同源基因，LC3-Ⅱ表達水平及LC3-Ⅱ／Ⅰ比值大小可反映自噬水平的高低；P62是特異性自噬途徑降解蛋白，其表達水平與自噬激活程度成反比[17-18]。本研究中模型組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯增強，P62蛋白表達水平顯著降低，表明腦中風后神經元自噬被過度激活。潘思敏等[19]研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中再灌注后神經細胞損傷嚴重，藥物治療后自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ下調，提示缺血性腦卒中再灌注的神經細胞損傷與過度自噬有關。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內酯注射液能抑制大腦中動脈阻塞大鼠缺血復灌后LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，以及自噬底物P62水平降低，阻止自噬水平過度升高，提示銀杏內酯注射液具有治療缺血性腦卒中急性期神經損傷的作用，是通過抑制缺血再灌后內質網應激和過度自噬發(fā)揮作用的[20]。本研究得到類似結果，腹腔注射銀杏內酯注射液后，低劑量組與高劑量組Beclin-1和LC3-Ⅱ下調，P62上調，提示銀杏內酯注射液可能通過抑制神經元過度自噬從而發(fā)揮對神經細胞的保護作用。

綜上所述，銀杏內酯注射液對大鼠腦中風恢復期具有改善作用，而且可能通過抑制神經元過度自噬發(fā)揮對神經細胞的保護作用，為臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。