除濕健脾湯對潰瘍性結腸炎小鼠IL-10/JAK1/STAT3通路及腸上皮細胞凋亡的影響*

陳志濤，鄭 軼，楊 靜，盧亞奇

（武漢市中心醫(yī)院，湖北 武漢 430014）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性炎癥性腸病，多種因素刺激可導致機體免疫反應異常，放大炎癥反應，引起腸黏膜組織持續(xù)損傷，因此抑制免疫炎癥是治療潰瘍性結腸炎的核心[1-2]。Janus激酶（Janus kinase，JAK）為非受體蛋白酪氨酸激酶家族，信號轉導轉錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）是一種能與靶基因調控區(qū)DNA結合的胞質蛋白家族，JAK家族成員可與STAT家族成員組成多條JAK/STAT信號通路[3]。其中，白介素-10（IL-10）就可通過激活炎性細胞內(nèi)JAK1/STAT3通路而發(fā)揮抗炎作用[4]。除濕健脾湯，出自《萬病回春》卷三，具有健脾除濕的功效，主治“久瀉色蒼而齒疏倦怠，食減下墜”[5]。健脾除濕法可顯著改善腸道菌群[6]，因此本研究推測除濕健脾湯加減可能治療UC，并通過使用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導小鼠建立UC模型，觀察除濕健脾湯對UC的治療效應并分析與IL-10/JAK1/STAT3通路的關系，以期為除濕健脾湯應用于UC治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級BALB/c小鼠60只，體質量20 g左右，購自北京北生研生物制品有限公司，動物許可證號：SYXK（京）2016-0051。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±2）℃，濕度50%，正常飲食，光照明/暗（12/12h）。本實驗經(jīng)本院動物倫理委員會批準，并遵守3R保護原則進行實驗。

1.2 藥物與試劑 除濕健脾湯，方藥組成：白術5 g，蒼術3 g，白茯苓3 g，白芍3 g，當歸2 g，厚樸2 g，陳皮2 g，豬苓1.5 g，澤瀉1.5 g，柴胡2 g，升麻2 g，防風2 g，甘草1 g。

本研究所需中藥均購自北京同仁堂。參考文獻[7]將上述藥材加水煮，過濾濃縮，提取有效成分，制得干膏。葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國Sigma Aldrich公司，批號：D4911）；美沙拉嗪（上海愛的發(fā)制藥有限公司，國藥準字H20143164）；IL-10抗體（貨號：ab189392）、JAK1抗體（貨號：ab133666）、STAT3抗體（貨號：ab68153）、β-actin抗體（貨號：ab8226）、山羊抗兔IgG多克隆抗體（貨號：ab150077）（英國Abcam公司）；小鼠IL-6 ELISA試劑盒（貨號：BMS603-2）、IL-10 ELISA試劑盒（貨號：88-7105-22）、TNF-α ELISA試劑盒（貨號：BMS607-3）[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；伊紅蘇木精試劑盒（貨號：C0105）、蛋白提取試劑盒（貨號：P0028）、BCA試劑盒（貨號：P0012）、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：C1098）（上海碧云天公司）。

1.3 主要儀器FC型酶標儀（上海沃元科技有限公司）；RM2235手動輪轉式切片機（德國Leica公司）；MM800型光學顯微鏡（日本尼康公司）；PowerPac HC型蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；GIS-500凝膠成像儀（杭州Miulab公司）。

1.4 造模與分組 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組，模型組，美沙拉嗪組和除濕健脾湯低、中、高劑量組，每組10只。參照文獻[8]，采用DSS誘導法建立UC模型。除空白對照組外，其余小鼠每天自由飲用5% DSS溶液100 mL，連續(xù)1周；空白對照組小鼠每天正常飲水。待小鼠出現(xiàn)腹瀉血便、體質量下降等癥狀，表明潰瘍性結腸炎模型復制成功。

1.5 實驗給藥 根據(jù)實驗動物等量劑量換算，使用蒸餾水將除濕健脾湯提取物分別配制為5、10、15 mg/mL溶液，從造模第1天起，除濕健脾湯低、中、高劑量組小鼠按照1 mL/kg劑量灌胃，美沙拉嗪組灌胃給予美沙拉嗪片劑水溶液，0.4 g/kg[9]，空白對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)14 d。動物飼養(yǎng)期間自由飲食飲水。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況觀察 實驗過程中，每天觀察小鼠的精神活動狀態(tài)、記錄小鼠體質量變化，觀察糞便性狀及便血情況。參照文獻[10]，計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，評分標準見表1。DAI=（體質量減輕率分數(shù)＋大便性狀分數(shù)＋便血程度分數(shù)）/3。

表1 DAI評分標準

1.6.2 標本采集 最后一次灌胃24 h后，小鼠經(jīng)眼球取血后斷頸處死。血液經(jīng)過離心后取血清，-20℃中保存?zhèn)溆谩＝馄市∈?，取出整段結腸，并測量長度及質量。從結腸病變處截取2～3 cm，置于10%甲醛溶液中固定，其余病變結腸組織置于-80℃中凍存。

1.6.3 結腸組織病理學檢測 取出在甲醛中固定的結腸組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，HE染色后觀察病理學變化。并參照文獻[11]對結腸組織進行組織損傷指數(shù)（tissue damage index，TDI）評分。

1.6.4 ELISA檢測血清中IL-6、IL-10和TNF-α（腫瘤壞死因子-α）含量 根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、IL-10和TNF-α含量。使用酶標儀測定OD450值，計算樣品濃度。

1.6.5 腸上皮細胞凋亡情況檢測 利用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒對小鼠腸上皮細胞的凋亡情況進行檢測。操作步驟：脫蠟，蛋白酶消化20 min后清洗，加入TUNEL反應混合液，于37℃下封閉30 min，加底物顯色，蘇木素復染，脫水，封片。每組分別隨機選取10張切片，每張切片選擇10個具有代表性的高倍視野（×400），計數(shù)500個細胞中TUNEL染色的陽性細胞數(shù)，采用凋亡指數(shù)表示，凋亡指數(shù)=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.6.6 Western blotting檢測小鼠結腸組織中IL-10、JAK1、STAT3蛋白表達水平 取出在-80℃凍存的結腸組織，按照蛋白提取說明書提取總蛋白并測定蛋白含量。每孔上樣50 μg，經(jīng)過電泳轉膜，加一抗、二抗，顯色曝光，拍照，分析數(shù)據(jù)。其中，β-actin為內(nèi)參蛋白，灰度值比值為該蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況及DAI評分比較 空白對照組小鼠精神狀態(tài)良好，飲食飲水正常，大便正常無隱血現(xiàn)象，體質量均無明顯下降；模型組小鼠精神呆滯，行動緩慢，進食少，體質量明顯下降，大便隱血或便血，并且癥狀逐漸加重；給藥后，美沙拉嗪組和除濕健脾湯低、中、高劑量組小鼠精神狀況改善，飲食飲水恢復正常，體質量有所增加，無肉眼便血，少數(shù)大便隱血。與空白對照組比較，模型組小鼠DAI評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，除濕健脾湯高劑量組和美沙拉嗪組小鼠DAI評分明顯下降（P＜0.05）；除濕健脾湯高劑量組小鼠DAI評分與美沙拉嗪組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠DAI評分比較（±s，分）

表2 各組小鼠DAI評分比較（±s，分）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（g/kg）DAI評分空白對照組 10 - 0.19±0.12模型組 10 - 2.79±0.72a除濕健脾湯低劑量組10 5.0 2.03±0.52除濕健脾湯中劑量組10 10.0 1.86±0.54除濕健脾湯高劑量組10 15.0 1.05±0.46b美沙拉嗪組 10 0.4 1.08±0.39b

2.2 各組小鼠結腸長度和質量比較 模型組小鼠單位結腸整體長度明顯短于空白對照組（P＜0.05），單位結腸質量明顯高于空白對照組（P＜0.05）；除濕健脾湯高劑量組小鼠單位結腸長度明顯長于模型組（P＜0.05），單位結腸質量明顯低于模型組（P＜0.05）；除濕健脾湯低、中劑量組小鼠單位結腸長度和質量均有所改善，但與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；除濕健脾湯高劑量組小鼠單位結腸長度和質量與美沙拉嗪組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠單位結腸長度和質量比較（±s）

表3 各組小鼠單位結腸長度和質量比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg） 結腸長度（cm/g） 結腸質量（g/cm）空白對照組 10 - 36.53±4.18 0.027±0.004模型組 10 - 27.82±4.36a 0.036±0.003a除濕健脾湯低劑量組10 5.0 29.29±5.12 0.035±0.004除濕健脾湯中劑量組10 10.0 30.17±3.94 0.033±0.006除濕健脾湯高劑量組10 15.0 33.57±4.25b 0.030±0.005b美沙拉嗪組 10 0.4 34.48±3.15b 0.029±0.004b

2.3 除濕健脾湯對UC小鼠結腸組織病理學的影響 空白對照組小鼠結腸組織完整，結構清晰，腺體排列整體，上皮細胞排列整齊，無缺損，無病變；模型組小鼠結腸組織結構異常，腺體排列紊亂，廣泛缺失，黏膜表層破壞，可見炎癥細胞大量浸潤；美沙拉嗪組和除濕健脾湯中、高劑量組小鼠結腸組織結構基本恢復正常，黏膜缺損減輕，炎癥細胞浸潤減少，較模型組明顯改善；除濕健脾湯低劑量組小鼠結腸組織病理變化程度介于模型組和除濕健脾湯中劑量組之間。（見圖1）

圖1 各組小鼠結腸組織病理切片圖（HE，×200）

模型組小鼠TDI評分明顯高于空白對照組（P＜0.05），除濕健脾湯低、中、高劑量組小鼠TDI評分明顯低于模型組（P＜0.05），且呈劑量依賴性。除濕健脾湯高劑量組小鼠TDI評分與美沙拉嗪組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠TDI評分比較（±s，分）

表4 各組小鼠TDI評分比較（±s，分）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與除濕健脾湯低劑量組比較，cP＜0.05；與除濕健脾湯中劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）TDI評分空白對照組 10 - 0.00±0.00模型組 10 - 3.92±0.42a除濕健脾湯低劑量組10 5.0 3.46±0.29b除濕健脾湯中劑量組10 10.0 2.85±0.15bc除濕健脾湯高劑量組10 15.0 1.59±0.23bcd美沙拉嗪組 10 0.4 1.34±0.18bcd

2.4各組小鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α含量比較 模型組小鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量明顯高于空白對照組（P＜0.05），除濕健脾湯低、中、高劑量組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯低于模型組（P＜0.05），且呈劑量依賴性。除濕健脾湯高劑量組小鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量與美沙拉嗪組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表5 各組小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與除濕健脾湯低劑量組比較，cP＜0.05；與除濕健脾湯中劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）IL-6 IL-10 TNF-α空白對照組 10 - 10 - 56.42±4.31 36.86±5.17 25.32±3.27模型組 413.29±26.72a 364.08±14.95a 311.91±23.16a除濕健脾湯低劑量組10 5.0 349.63±21.86b 173.43±21.58b 243.62±19.54b除濕健脾湯中劑量組10 10.0 284.67±18.37bc 131.89±15.42bc 195.34±17.56bc除濕健脾湯高劑量組10 15.0 175.59±23.94bcd 93.16±20.84bcd 102.48±18.84bcd美沙拉嗪組 10 0.4 169.85±15.47bcd 91.32±13.85bcd 106.92±15.36bcd

2.5 各組小鼠腸上皮細胞凋亡情況比較 空白對照組小鼠結腸組織偶爾可見凋亡細胞；模型組小鼠上皮細胞凋亡指數(shù)明顯高于空白對照組（P＜0.05）；與模型組比較，除濕健脾湯低、中、高劑量組小鼠上皮細胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。其中，除濕健脾湯高劑量組小鼠上皮細胞凋亡指數(shù)與美沙拉嗪組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖2、表6）

圖2 各組小鼠結腸組織上皮細胞凋亡圖（×200）

表6 各組小鼠上皮細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表6 各組小鼠上皮細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與除濕健脾湯低劑量組比較，cP＜0.05；與除濕健脾湯中劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）凋亡指數(shù)（%）空白對照組 10 - 0.68±0.14模型組 10 - 21.37±3.24a除濕健脾湯低劑量組10 5.0 13.19±2.16b c除濕健脾湯中劑量組10 10.0 8.86±1.45b c d除濕健脾湯高劑量組10 15.0 3.56±0.89b c d美沙拉嗪組 10 0.4 3.34±0.76b c d

2.6 各組小鼠結腸組織中IL-10、JAK1、STAT3蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，模型組小鼠結腸組織中IL-10、JAK1、STAT3蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組和除濕健脾湯低、中、高劑量組小鼠結腸組織中IL-10、JAK1、STAT3蛋白相對表達量明顯下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。除濕健脾湯高劑量組小鼠結腸組織中IL-10、JAK1、STAT3蛋白相對表達量與美沙拉嗪組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖3、表7）

圖3 各組小鼠結腸組織Western blotting圖

表7 各組小鼠結腸組織IL-10、JAK1、STAT3蛋白表達水平比較（±s）

表7 各組小鼠結腸組織IL-10、JAK1、STAT3蛋白表達水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與除濕健脾湯低劑量組比較，cP＜0.05；與除濕健脾湯中劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）IL-10/β-actin JAK1/β-actin STAT3/β-actin空白對照組 10 組 10 - 0.18±0.06 0.13±0.04 0.14±0.03模型- 0.85±0.14a 0.81±0.13a 0.82±0.13a除濕健脾湯低劑量組10 5.0 0.76±0.11b 0.54±0.16b 0.68±0.15b除濕健脾湯中劑量組10 10.0 0.43±0.12b c 0.36±0.08b c 0.49±0.10b c除濕健脾湯高劑量組10 15.0 0.21±0.05b c d 0.18±0.05b c d 0.24±0.07b c d美沙拉嗪組 10 0.4 0.23±0.06b c d 0.16±0.02b c d 0.22±0.05b c d

3 討 論

潰瘍性結腸炎是一種影響結腸的慢性、特發(fā)性炎癥性疾病，最常見于30～40歲的成年人，并導致殘疾[12]。其特征臨床表現(xiàn)為黏膜炎癥的復發(fā)和緩解，開始于直腸，并延伸至結腸的近段。其中，結腸的慢性炎癥是UC的主要臨床表現(xiàn)[13]。本研究采用DSS誘導小鼠建立UC模型，結果顯示小鼠體質量明顯下降，小鼠隱血或便血，單位結腸整體程度縮短，單位結腸質量升高，DAI評分明顯升高，血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量明顯升高。顯微鏡下觀察到小鼠結腸組織結構破壞，腺體紊亂，黏膜表層嚴重破壞，可見大量炎癥細胞浸潤，腸上皮細胞大量凋亡，表明模型建立成功。

除濕健脾湯具有健脾滋陰、養(yǎng)胃和胃、清熱祛濕的作用，在臨床應用上具有悠久歷史。方中茯苓、白術為君藥，茯苓歸脾、腎經(jīng)，既能補脾虛，又是祛濕圣藥，白術歸脾、胃經(jīng)，可強脾胃，除濕燥；臣藥陳皮和氣健脾，祛濕化痰[14]；炙甘草為使藥，調和諸藥，諸藥合用，相輔相成，標本兼治，共奏益氣健脾、祛濕化濁之功效[15]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，茯苓中有效成分能夠抑制炎癥因子釋放[16]；參苓白術散可以通過抑制腸道黏膜組織中細胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α）釋放，從而緩解DSS結腸炎大鼠的炎癥反應[17]；賀燕林等[18]研究發(fā)現(xiàn)陳皮提取物可降低模型細胞NO釋放量，具有顯著抗炎作用。

本研究根據(jù)參考文獻制備除濕健脾湯提取物[7]，并治療UC小鼠，結果顯示，小鼠結腸組織結構損傷、炎性細胞浸潤等癥狀減輕，結構基本恢復，小鼠體質量升高，腸上皮細胞凋亡數(shù)量減少，DAI評分明顯降低，血清中炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α含量明顯降低，且呈劑量依賴性，表明除濕健脾湯可減輕小鼠炎癥反應，緩解結腸組織病變，并隨劑量升高作用增強。

IL-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子，可與單核細胞、巨噬細胞等細胞表面IL-10受體（IL-10R）結合，進而激活JAK1/STAT3通路，調節(jié)細胞生長與分化，參與炎癥反應和免疫反應等。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠結腸組織IL-10、JAK1、STAT3蛋白相對表達量明顯升高，說明IL-10可激活JAK1/STAT3通路，增強UC小鼠自身抗炎作用。湯托等[19]研究發(fā)現(xiàn)金盞花苷E可通過抑制JAK1/STAT3通路，抑制LPS誘導的炎癥反應。李自立等[20]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過抑制JAK1/STAT3通路減少小鼠動脈血管內(nèi)的氧化應激及炎癥損傷。本研究采用除濕健脾湯提取物處理后，UC小鼠結腸組織IL-10、JAK1、STAT3蛋白相對表達量明顯降低，且隨著藥物劑量增加而更顯著，表明除濕健脾湯可減少IL-10炎癥因子，下調JAK1/STAT3通路蛋白表達，推測除濕健脾湯可能通過抑制IL-10/JAK1/STAT3蛋白，減輕UC小鼠炎癥反應，從而起到治療作用。

綜上所述，除濕健脾湯可能通過抑制IL-10/JAK1/STAT3通路，減輕UC小鼠炎癥反應，修復小鼠結腸組織，減少腸上皮細胞凋亡，改善腸道功能，為臨床潰瘍性結腸炎的治療提供了新思路，但具體作用機制仍有待于進一步研究。