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    ICU病區(qū)泛耐藥的鮑曼不動桿菌碳青霉烯類藥物耐藥基因分析

    2012-04-03 03:21:34陳士華魏取好呂火烊
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2012年6期
    關(guān)鍵詞:烯類青霉抗菌

    陳士華 魏取好 呂火烊

    泛耐藥(pandrug-resistant,PDR)是指分離菌株對臨床常用的絕大多數(shù)抗菌藥物均耐藥的菌株。鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)特別是泛耐藥的鮑曼不動桿菌(pandrug-resistant Acinetobacter baumannii,PDR-AB)是院內(nèi)定植及導(dǎo)致難治性醫(yī)院感染的主要病原體[1,2]。隨著廣譜或超廣譜抗菌藥物的廣泛及不協(xié)規(guī)范的使用,導(dǎo)致PDR-AB發(fā)生率增高,PDR-AB的耐藥機制復(fù)雜,且多種耐藥機制共存,常見的包括β-內(nèi)酰胺酶特別是碳青霉烯酶的產(chǎn)生、藥物作用靶位的改變、外膜通透性下降及藥物主動外排等等。近年來,研究表明PDR-AB對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥主要其產(chǎn)生多動碳青霉烯類酶,如blaVIM、blaNDM-1和blaIMP和OXA酶,而其中最為多見的為OXA酶。OXA酶可分為4個族,第1族是blaOXA-23,第2族是blaOXA-24,第3族是blaOXA-51和第4族blaOXA-58,其中第1族和第4族是由質(zhì)粒介導(dǎo),而中間2和3族是由染色體介導(dǎo)[3]。本研究對近2年分離自筆者醫(yī)院的20株P(guān)DR-AB進行了耐藥性及耐藥基因的檢測,現(xiàn)報道如下。

    材料與方法

    1.菌株來源:2009年1月~2010年12月從筆者醫(yī)院ICU病區(qū)分離的泛耐藥的鮑曼不動桿菌(pandrug-resistant Acinetobacter baumannii,PDR-AB)20株,所有菌株均由Vitek-32全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定及藥物敏感性試驗篩查。質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922,銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

    2.儀器與試劑:全自動微生物鑒定系統(tǒng)Vitek-32及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI+);哌拉西林(piperacillin,PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam,TZP)、頭孢噻肟(cefotaxime,CTX)、頭孢他啶(ceftazidime,CAZ),頭孢曲松(ceftriaxone,CRO),頭孢吡肟(cefepime,F(xiàn)EP),頭孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam,CPS),亞胺培南(imipenam,IMP),美羅培南(meropenem,MEM),慶大霉素(gentamycin,GEN),阿米卡星(amikacin,AMK),環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP),米諾環(huán)素(minocycline,MIN),復(fù)方新諾明(trimethoprim-sulfamethoxazole,SXT)和多黏菌素B(polymyxin B,POB)E-試條均購自法國梅里埃公司;PE-9700 PCR儀(美國ABI公司);Eppendorf 5417R高速離心機(德國艾本得); Bio-Rad GelDoc凝膠電泳成像分析系統(tǒng) (美國伯樂公司); MH瓊脂干粉購自英國OXIOD公司;PCR通用試劑盒EmeraldAmpTMPCR Master Mix及DNA分子質(zhì)量標準 DL2000TMDNA Marker均為寶生物工程(大連)有限公司新產(chǎn)品,各種耐藥基因引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,其序列見表1。

    表1 PCR擴增基因種類引物序列及產(chǎn)物大小(bp)

    3.菌株鑒定及抗菌藥物的耐藥性試驗:按全自動微生物鑒定系統(tǒng)Vitek-32及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI +)使用說明書對菌株進行鑒定;哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ),頭孢曲松(CRO),頭孢吡肟(FEP),頭孢哌酮/舒巴坦(CPS),亞胺培南(IMP),美羅培南(MEM),慶大霉素(GEN),阿米卡星(AMK),環(huán)丙沙星(CIP),米諾環(huán)素(MIN),復(fù)方新諾明(SXT)和多黏菌素B(POB)的耐藥性檢測用濃度梯度法(E-試條法),其耐藥性解釋標準(除CPS)參照CLSI2011中關(guān)于不動桿菌屬的規(guī)定[4];CPS的解釋標準參照輝瑞公司建議的標準(MIC值:≤16 S,32 I,≥64 R)。

    4.耐藥基因檢測:模板DNA的提取各種靶基因PCR擴增檢測參加文獻進行略作修改[5]。具體為:每反應(yīng)體系P1引物1μl(1.0μmol/L)、P2引物 1μl(1.0μmol/L),dNTPs 2μl (2mmol/L),10倍緩沖液2μl[KCl 10mmol/L,(NH4)2SO48mmol/L,MgCl22mmol/L,Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L,NP400.5%,BSA 0.02%(wt/vol)],Taq DNA pol1U(不計體積),超純水9μl,模板液5μl,總反應(yīng)體積20μl。PCR擴增熱循環(huán)參數(shù)均為:94℃預(yù)變性2min,然后94℃ 60s→50℃ 60s→72℃ 60s,循環(huán)35周期,最后1個72℃延長至5min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)與陽性對照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽性。

    結(jié)果

    1.抗菌藥物濃度梯度法檢測結(jié)果:20株P(guān)DRAB對PIP、TZP、CTX、CAZ、CRO、FEP、CPS、IMP、MEM、GEN、CIP的耐藥率均為100%;AMK的耐藥率55%,MIN的耐藥率70%,SXT的耐藥率80%,POB的耐藥率為0%;各菌株的詳細結(jié)果見表2。

    2.耐藥基因PCR擴增結(jié)果:20株P(guān)DR-AB株,檢測blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58、blaVIM、blaNDM-1和blaIMP 7種耐藥基因,檢測blaOXA-23、blaVIM和blaIMP基因陽性9株,陽性率45%;blaOXA-23陽性,6株,占陽性菌株中的66.7%(6/9),分別為1號、5號、6號、9號、12號和17號菌株;blaVIM陽性2株,占陽性菌株中的22.2%(2/9),分別為2號和15號菌株;blaIMP陽性1株,為19號菌株。20株 PDR-AB PCR擴增blaOXA-23基因電泳結(jié)果見圖1。

    表2 20株P(guān)DR-AB對15種抗菌藥物耐藥性的體外檢測結(jié)果

    圖1 PCR擴增blaOXA-23基因結(jié)果

    討論

    ICU病區(qū)由于病人基礎(chǔ)疾病較重,抗菌藥物使用較廣,多耐藥菌株的分離率相對較高。PDR-AB是這些菌株中的典型代表菌,為條件致病菌,近年來已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一,引起的感染逐年增加[6~8]。筆者醫(yī)院ICU分離到的20株P(guān)DR-AB對臨床常用的14種抗菌藥物中的11種全部耐藥,只對阿米卡星(AMK)、米諾環(huán)素(MIN),復(fù)方新諾明(SXT)3種部分菌株敏感;而對臨床不常用的多黏菌素B,所有菌株均敏感(表2)。對由PDR-AB感染的病人,臨床可綜合考慮選用阿米卡星(AMK)、米諾環(huán)素(MIN),復(fù)方新諾明(SXT)及多黏菌素B進行治療。

    研究表明,PDR-AB對碳青霉烯類藥物的耐藥機制由以下幾個因素引起,一是產(chǎn)生各種碳青霉烯類酶(包括金屬β-內(nèi)酰胺酶),二是青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的改變,三是通透性的改變(如膜孔蛋白OprD的缺失),四是主動外泵的增加等,而其中最為主要的因素是產(chǎn)生各種碳青霉烯類酶[9~11]。本研究對20株P(guān)DR-AB主要檢測了blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58、blaVIM、blaNDM-1和blaIMP 7種碳青霉烯類藥物的耐藥基因。檢測到blaOXA-23、blaVIM和blaIMP基因陽性9株,陽性率45%;其中blaOXA-23陽性,6株,占陽性菌株中的66.7%(6/9);blaVIM陽性2株,占陽性菌株中的22.2%(2/9);blaIMP陽性1株,占陽性菌株中的11.1%(1/9)(圖1)。說明筆者醫(yī)院ICU病區(qū)的PDR-AB可能存在有3種以上的碳青霉烯酶基因,而在這些基因中又以blaOXA-23為主。OXA類酶為Bush分類中的D類(2d)β-內(nèi)酰胺類酶,結(jié)構(gòu)上與C類青霉素結(jié)合蛋白相關(guān),具有活性絲氨酸位點,能水解碳青霉烯類菌物,不能被克拉維酸抑制。編碼OXA類酶的基因blaOXA可以在染色體上,質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)座子上。目前已發(fā)現(xiàn)140多種OXA類酶。OXA型酶耐藥譜一般較窄,但近年來可水解第3代頭孢菌素和(或)亞胺培南的超廣譜OXA酶不斷被發(fā)現(xiàn),主要由OXA-2或OXA-10突變衍生而來,其編碼基因通常位于質(zhì)粒或整合子上,具有很強的擴散能力。對鮑曼不動桿菌的研究主要集中在4族突變(blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58)體上,blaOXA-23為其中的一族(包括blaOXA-23、blaOXA27和blaOXA-49),由質(zhì)粒介導(dǎo)[3],易引起傳播,故臨床對分離到此PDR-AB的病人應(yīng)盡快做好隔離。

    本研究檢測到另外2型碳青霉烯酶基因blaVIM和blaIMP,均為金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-betalactamase,MBL)基因,能水解除單環(huán)類抗菌藥外包括碳青霉烯類在內(nèi)的幾乎全部的β-內(nèi)酰胺類抗生素,基因可位于染色體或質(zhì)粒高度可移動遺傳因子上,并可被整合子捕獲,這使得MBLs基因具有可傳播性,MBLs不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制,成為治療的一大難題[12,13]。

    綜合本研究結(jié)果,筆者醫(yī)院ICU病區(qū)分離的PDR-AB對臨床絕大多數(shù)抗菌藥物耐藥,選用抗菌藥物應(yīng)依據(jù)實驗室的檢測結(jié)果。對碳青霉烯類藥物的耐藥機制檢測表明,筆者醫(yī)院ICU病區(qū)的PDRAB以產(chǎn)blaOXA-23型碳青霉烯類酶為主,其次為blaVIM和blaIMP金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL),由于這些基因均可在質(zhì)粒上且可被整合子捕獲,因此很容易在菌株或菌屬之間傳播,因此臨床加強對此類菌的監(jiān)測及預(yù)防隔離工作。

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