復發(fā)性流產孕婦血清及胚胎組織中Klotho蛋白表達水平的分析

崔 進，張秀娟，祝 倩

（濰坊市婦幼保健院，山東 濰坊 261000）

據調查，在發(fā)生自然流產的孕婦中，復發(fā)性流產孕婦占1% ～5%[1-2]。研究發(fā)現，復發(fā)性流產的發(fā)生與孕婦的染色體異常、子宮結構及功能異常、發(fā)生感染、內分泌功能紊亂、存在自身免疫系統(tǒng)疾病等因素有關[3-5]。Klotho 蛋白是1997 年發(fā)現的一種抗衰老蛋白[6]。Klotho蛋白可參與到心血管疾病、腎臟損傷、腫瘤、代謝病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中[7]。近年來的研究結果顯示，Klotho 蛋白在子癇前期、子宮內膜異位癥、早產等婦產科疾病患者體內呈異常表達。有研究者認為，Klotho 蛋白可能通過與其受體結合影響相關信號的傳導通路[8]，引發(fā)基因突變、胚胎發(fā)育異常，進而導致孕婦發(fā)生流產。本次研究主要是分析復發(fā)性流產孕婦血清及胚胎組織中Klotho 蛋白表達的水平。

本次研究的對象是2019 年3 月至10 月期間在濰坊市婦幼保健院進行人工流產手術的80 例復發(fā)性流產孕婦及同期該院收治的100 例胚胎正常要求流產的孕婦。將其中80 例復發(fā)性流產孕婦設為復發(fā)性流產組，將其中100 例胚胎正常主動要求流產的孕婦設為正常妊娠要求流產組。復發(fā)性流產組孕婦的平均年齡為（28.5±1.3）歲，其流產時的平均孕周為（7.8±0.3）周。本組孕婦進行腹部超聲檢查的結果顯示其胚胎停止發(fā)育或孕7 周后多次腹部超聲檢查的結果提示其宮腔內無胎芽及胎心搏動。胚胎正常要求流產組孕婦的平均年齡為（26.5±1.8）歲，其流產時的平均孕周為（7.8±0.2）周。本組孕婦進行腹部超聲檢查可見其宮腔內存在胚芽及胎心搏動。兩組孕婦的一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.2 納入及排除標準

本次研究對象的納入標準是：1）既往身體健康，無內、外科疾病史；2）自然受孕；3）在此次妊娠的前3個月月經正常。本次研究對象的排除標準是：1）存在妊娠期并發(fā)癥；2）在妊娠期間接受過藥物治療。

1.3 標本采集方法

在對兩組孕婦進行人工流產手術前，均抽取其4 mL的空腹靜脈血。對抽取的血液樣本進行抗凝處理，然后放到離心機中進行10 min 的離心處理，離心機的轉速為3000 r/min。將分離出的血清樣本放到-80℃的冰箱中保存。在對兩組孕婦進行人工流產手術后的10 min 內，取大小約0.8 cm×0.8 cm 的胚胎組織。使用生理鹽水對胚胎組織進行3 次漂洗，將其分成兩份。將其中一份胚胎組織置入滅活RNA 酶凍存液中，并放到-80℃的冰箱中保存。將另一份胚胎組織使用10%甲醛固定液進行固定，然后進行石蠟包埋處理，制作成組織切片，放到60℃的烤箱中烘干，然后置于37℃的溫箱中保存。

1.4 檢測方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組孕婦血清中Klotho 蛋白的表達水平，采用免疫組織化學法檢測兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白的表達水平。嚴格按照檢測試劑盒的說明書進行操作。對切片組織進行高溫高壓抗原修復及DBA 顯色處理。將PBS 液代替一抗作為陰性對照品，將已知陽性的胚胎組織作為陽性對照品。Klotho 在細胞膜與細胞質中均有表達，鏡下表現為棕黃色顆粒。選取5個高倍鏡視野，將陽性細胞占正常細胞的百分比作為評估進行Klotho 蛋白檢測結果的標準。陽性細胞占正常細胞的百分比＜5%，計0 分。陽性細胞占正常細胞的百分比為5% ～20%，計1 分。陽性細胞占正常細胞的百分比為21%～50%，計2 分。陽性細胞占正常細胞的百分比＞50%，計3 分。若進行Klotho 蛋白檢測結果的評分為0 分、1 分，表示檢測結果為陰性。若進行Klotho蛋白檢測結果的評分為2 分、3 分，表示檢測結果為陽性。在免疫組織化學圖像分析儀上計算陽性細胞數和灰度值，由凝膠圖像分析處理系統(tǒng)完成圖像采集、定性和半定量檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件處理本次研究中的所有數據。計量資料用±s表示，用t檢驗。計數資料用%表示，采用χ2 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦血清Klotho 蛋白表達水平的比較

復發(fā)性流產組孕婦血清Klotho 蛋白的表達水平高于正常妊娠要求流產組孕婦，P＜0.05。詳見表1。

表1 兩組孕婦血清Klotho 蛋白表達水平的比較（ng/dl，± s）

表1 兩組孕婦血清Klotho 蛋白表達水平的比較（ng/dl，± s）

注：a 表示與正常妊娠要求流產組相比，P ＜0.05。

組別 Klotho 蛋白復發(fā)性流產組（n=80） 1.25±0.38 a正常妊娠要求流產組（n=100） 1.09±0.26 t 值 3.2410 P 值 0.0016

2.2 兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白表達水平的比較

復發(fā)性流產組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白的表達水平高于正常妊娠要求流產組孕婦，P＜0.05。詳見表2。

表2 兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白表達水平的比較（ng/dl，± s）

表2 兩組孕婦胚胎組織中Klotho 蛋白表達水平的比較（ng/dl，± s）

注：a 表示與正常妊娠要求流產組相比，P ＜0.05。

組別 Klotho 蛋白復發(fā)性流產組（n=80） 2.05±0.34a正常妊娠要求流產組（n=100） 1.66±0.35 t 值 7.4868 P 值 0.0013

3 討論

復發(fā)性流產的發(fā)生與孕婦的染色體異常、生殖器官結構異常、內分泌功能紊亂、感染等因素均有關。據調查，約有40% 的復發(fā)性流產孕婦的病因不能明確，且此類孕婦再次妊娠時發(fā)生流產的幾率高達70%～80%[9]。

1997 年，研究者發(fā)現了Klotho 蛋白。人體可以通過多種方式調控Klotho 蛋白的表達水平[10-11]。例如，成纖維生長因子-3 可提高Klotho 蛋白的表達水平[12-13]，腎素- 血管緊張素可以降低Klotho 蛋白的表達水平，從而發(fā)揮不同的生理作用。Klotho 蛋白的表達產物包括膜結合蛋白和分泌型蛋白。膜結合蛋白位于細胞膜及細胞質中，胞外區(qū)的蛋白序列與葡萄糖苷酶相似。分泌型蛋白存在于血液循環(huán)中，是一種肽類激素。這兩種蛋白的高表達均可通過影響機體相關元素的代謝對血管產生明顯的保護作用[14-15]。有報道指出，Klotho 蛋白亦參與到了腎病、不孕不育癥、皮膚萎縮、骨質疏松癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中。近年來，越來越多的研究發(fā)現，klotho蛋白可以調節(jié)胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）的信號通路，并可參與氧化應激反應的整個過程。這提示，Klotho 蛋白在基因突變、蛋白質空間構象異常的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[16]。在本研究中，復發(fā)性流產組孕婦外周血及胚胎組織中Klotho蛋白的表達水平均高于正常妊娠要求流產組孕婦，原因是：復發(fā)性流產孕婦體內高表達的Klotho 蛋白與細胞膜上的Klotho 蛋白受體結合后，可改變細胞的信號傳導通路，生成多種生物因子，并作用于母體的內皮組織，導致血管內皮細胞功能損傷及母體血管內皮組織因子被激活，影響細胞內外物質的轉運，引起基因突變、衰老甚至細胞死亡，進而可導致胚胎停止發(fā)育、孕婦發(fā)生流產。

本次研究的結果證實，與胚胎正常主動要求流產的孕婦相比，復發(fā)性流產孕婦血清及胚胎組織中Klotho 蛋白的表達水平較高。