蛋雞J亞型禽白血病病毒與大腸桿菌共感染的診斷

張世成，嚴(yán)天行，袁世玉，成子強

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271018）

禽白血病（Avianleukosis, AL）是由禽白血病?。ˋvian Leukosis Virus, ALV）引起的禽多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱[1]。根據(jù)囊膜糖蛋白的不同，ALV可以分為A-K等11個亞群，其中A、B、J亞群是最常分離到的病毒[2]。AL可以通過水平和垂直方式傳播，可以誘導(dǎo)雞的淋巴細(xì)胞瘤、髓樣細(xì)胞瘤、血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤以及其他形式的腫瘤[3]。盡管許多種禽公司實施了多年的檢疫和凈化，但ALV仍在商品代雞呈亞臨床感染狀態(tài)存在，不僅影響雞群的生產(chǎn)性能，而且導(dǎo)致免疫抑制，易繼發(fā)其他致病原的共感染。J亞群禽白血病病毒（Subgroup J Avian Leukosis Virus, ALV-J）是20世紀(jì)80年代從肉用型雞中分離鑒定的新亞群，主要引起肉用型雞的髓細(xì)胞瘤[2]。20世紀(jì)90年代，ALV-J在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，并對全球家禽業(yè)造成巨大的損失[3]。杜巖[4]等首次從我國大型肉用型種雞場分離鑒定出ALV-J，2004年中國首次報道蛋雞自然感染ALV-J[5]。近年來，禽病的發(fā)生和流行特點往往表現(xiàn)為多病原性，常見表 現(xiàn)為病毒病和細(xì)菌病的共感染[6]。大腸桿菌病是部分或全部由禽致病性大腸桿菌（Avian Pathogenic E. Coli,APEC）所引起的局部或全身性感染的疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

內(nèi)蒙古某養(yǎng)殖合作社送檢一批海蘭褐蛋雞，該養(yǎng)殖合作社為全自動現(xiàn)代化籠養(yǎng)，養(yǎng)殖規(guī)模30萬只。發(fā)病雞產(chǎn)蛋高峰期產(chǎn)蛋率下降至20 %，死亡率30 %，出現(xiàn)精神沉郁，虛弱，縮頸嗜睡，消瘦，排白色稀狀糞便，雞冠發(fā)白。為了明確病因，本研究對該批病雞采用大體剖檢、血象學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病理組織學(xué)、分子生物學(xué)及病原學(xué)方法對該場發(fā)病雞進(jìn)行系統(tǒng)檢測與分析，確診為J亞型禽白血病病毒與大腸桿菌共感染，為揭示兩者之間致病的關(guān)聯(lián)性和兩者共感染導(dǎo)致的ALV-J致病特征提供了依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源與樣品采集 內(nèi)蒙古某父母代種 雞場送檢的海蘭褐蛋雞，分別無菌采取心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、小腸等器官置于1.5 ml離心管中，用手術(shù)剪將病變明顯的組織固定于10%福爾馬林溶液中。

1.1.2 主要試劑與實驗器材 2×Accurate Taq預(yù)混液購自寶生物（大連）生物科技有限公司；組織DNA提取試劑盒（購于天根生物科技有限公司）；組織RNA提取試劑盒（購于天根生物科技有限公司）；血瓊脂平板購自于江門市凱林貿(mào)易有限公司；光學(xué)顯微鏡和數(shù)碼成像系統(tǒng)購自奧林巴斯公司；石蠟切片機購于德國徠卡公司；電熱恒溫干燥箱購自江蘇吳淞五金廠；PCR儀購自賽默飛世爾公司；電子天平購自上海精天電子儀器有限公司；生物安全柜購自上海博訊醫(yī)療器械公司；電泳儀購自上海市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 臨床觀察 將病雞自然平放在地上，安靜自然地觀察其精神狀態(tài)、飲食飲水、運動情況及糞便形態(tài)等。

1.2.2 血象學(xué)觀察 將病雞固定好，用1 ml注射器從翅下采血，滴一滴于載玻片上，用輕柔的力量迅速均勻推出，形成一薄層，自然晾干，瑞氏姬姆薩染色，顯微鏡觀察。

1.2.3 ELISA-P27病原學(xué)檢測 采集病雞泄殖腔棉拭子，按照IDEXX ALV-P27抗原檢測試劑盒步驟進(jìn)行ELISA抗原檢測。

1.2.4 大體剖檢與病理組織學(xué)觀察 無菌采取心臟、肝臟、腎臟、胸腺、法氏囊、脾臟和小腸等，并將病健交界處的組織固定于10%福爾馬林溶液中，然后經(jīng)二甲苯透明后進(jìn)行浸蠟、包埋、冷卻、切片，最后將切片進(jìn)行烘干和HE染色，將染色好的組織切片置于顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.2.5 細(xì)菌分離與鑒定 將接種環(huán)置于火焰外焰灼燒，將組織用烙鐵燙一區(qū)域，切開一小口，無菌取病料劃線接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，于37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，搖菌至菌液渾濁，提取菌液DNA，16S rRNA 鑒定引物進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系25 μl：2×Accurate Taq Mix 12.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，樣品1 μl，ddH2O 10.5 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸120 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將PCR擴增后陽性樣品送至華大生物工程有限公司測序，將測序回來的序列結(jié)果與NCBI GenBank的參考序列進(jìn)行BLAST分析驗證。

1.2.6 常見病毒的分子生物學(xué)檢測 采集黃豆?fàn)畲笮〉母闻K、脾臟、腎臟等，研磨成細(xì)胞懸液后，分別進(jìn)行DNA和RNA提取，并把RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用HEV、REV、MDV、IBDV、AIV（H9N2）、ALV-A、ALV-B和ALV-J引物進(jìn)行PCR擴增，以合成的cDNA和DNA為模板進(jìn)行PCR擴增（引物如表1所示）。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察與大體剖檢結(jié)果

臨床觀察病雞精神沉郁，縮頸嗜睡，消瘦，排白色稀狀糞便，無法站立，雞冠發(fā)白。剖檢觀察主要表現(xiàn)為：雞肝臟腫大破裂；腎臟淡灰色腫脹；輸卵管充血，內(nèi)有大量干酪樣滲出物填充整個輸卵管；脾臟和卵巢萎縮（圖1）。

圖1 臨床和大體剖檢觀察結(jié)果 A.輸卵管充血腫脹；B.腎臟呈淡灰色腫脹；C.肝臟腫脹破裂；D.脾臟萎縮； E.輸卵管填充的黃色干酪狀物質(zhì)；F.病雞精神沉郁、縮頸嗜睡

2.2 血象學(xué)檢查結(jié)果

血象學(xué)檢查可見血液中幼稚紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、異嗜性粒細(xì)胞、粒性髓細(xì)胞和成紅細(xì)胞增多（圖2）。

圖2 血象學(xué)檢查結(jié)果 A.單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多；B.淋巴細(xì)胞增多；C.成紅細(xì)胞和粒性髓細(xì)胞增多；D為異嗜性粒細(xì)胞減少； E.淋巴細(xì)胞、骨髓成紅細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞增多；F.成紅細(xì)胞和成髓細(xì)胞增多

2.3 病原學(xué)檢測

P27 ELISA病原學(xué)檢測結(jié)果顯示1-3號病雞檢測為肛拭子ALVp27抗原陽性，4號病雞檢測為肛拭子ALVp27抗原陰性，5號病雞判定為可疑（表2）。

表2 ELISA病原學(xué)檢測

2.4 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

病理組織學(xué)觀察病雞肝細(xì)胞顆粒變性、壞死，淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞浸潤，血管內(nèi)和血管外集聚有大量的成髓細(xì)胞，腸絨毛上皮細(xì)胞脫落以及脾臟淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)生流失、透明變性和壞死（圖3）。

圖3 病理組織學(xué)觀察結(jié)果 A.雞肝細(xì)胞顆粒變性、壞死，肝細(xì)胞腫脹，肝竇間隙充盈大量紅細(xì)胞；B.雞肝臟淋巴細(xì)胞浸潤變性壞死區(qū)； C.雞脾臟淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞脾臟大量流失，發(fā)生透明變性和壞死；D.雞小腸腸絨毛上皮細(xì)胞脫落明顯；E.雞肝臟局部肝竇空隙充滿大量紅細(xì)胞，肝細(xì)胞變性壞死區(qū)明顯；F.雞脾臟淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞透明變性、壞死

2.5 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.5.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 細(xì)菌分離培養(yǎng)觀察到主要為灰白色、圓形、透明、表面光滑、邊緣整齊、露珠狀的菌落，經(jīng)鑒定菌株為大腸桿菌（圖4）。

圖4 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

2.5.1 細(xì)菌序列比對結(jié)果 將菌液DNA經(jīng)細(xì)菌16S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR擴增后，將擴增后的產(chǎn)物送華大生物工程公司進(jìn)行測序，序列回來的結(jié)果與NCBI GenBank已發(fā)布的參考序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示分離的菌株與大腸桿菌ST95-32株和OW1E2株同源性為100 %，結(jié)合臨床觀察、大體剖檢、血象學(xué)和病理組織學(xué)結(jié)果確定大腸桿菌是引起發(fā)病的致病菌。

2.6 PCR鑒定結(jié)果

根據(jù)大體剖檢、血象學(xué)和病理組織學(xué)結(jié)果，懷疑是戊肝病毒或禽流感病毒或免疫抑制病毒與細(xì)菌病混合感染，因此將HEV、REV、MDV、IBDV、AIV（H9N2）、ALV-A、ALV-B、ALVJ、ALV-E和ALV-K進(jìn)行PCR或RT-PCR擴增，結(jié)果顯示病雞HEV、REV、MDV、IBDV、AIV（H9N2）、ALV-A、ALV-B、ALV-E和ALV-K為陰性，ALV-J呈陽性。將凝膠切下送華大生物工程有限公司進(jìn)行測序，用DNA Star軟件進(jìn)行序列比對分析，結(jié)合病理組織學(xué)結(jié)果、大體剖檢結(jié)果、血象結(jié)果分析及測序比對結(jié)果確診病雞為ALV-J感染（圖5）。

圖5 常見病原的PCR檢測結(jié)果

2.7 ALV-J env發(fā)育進(jìn)化樹分析

將 ALV-Jenv擴增序列在 NCBI進(jìn)行BLAST，應(yīng)用DNAStar基因分析軟件，對測序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列剪切、拼接。應(yīng)用MEGA分析軟件，將擴增拼接后的ALV env保守序列與GenBank中已公開的ALVenv保守序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用Neighbor-joining生成系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap值來評估進(jìn)化樹的可靠性。結(jié)果顯示均有5株ALV env保守序列同源性較低，其中兩株ALVenv保守序列同源性較高，可能同一毒株在不同個體產(chǎn)生了變異（圖6）。

圖6 ALV-Jenv系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

3 討論

禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）引起的一種腫瘤性免疫抑制病，J亞群ALV（ALV-J）不僅可以引起雞的髓樣細(xì)胞瘤等原發(fā)感染，也可以引起免疫抑制，繼發(fā)其他病原的共感染。本研究對內(nèi)蒙古某海蘭褐父母代發(fā)病蛋雞進(jìn)行了系統(tǒng)檢測、分析，最終確診為ALV-J與大腸桿菌的共感染，這為揭示兩者之間致病的關(guān)聯(lián)性和兩者共感染導(dǎo)致的ALV-J致病特征提供了依據(jù)和參考。

本研究從臨床發(fā)病的蛋雞分離到5株ALVJ。對發(fā)病雞場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，5株ALV-J來自三個不同雞舍，同源性較高的毒株來自同一雞舍，同源性相近的ALV-J株可能是同一毒株在不同個體適應(yīng)性不同而發(fā)生了變異。經(jīng)調(diào)查該發(fā)病雞場養(yǎng)殖模式為全封閉全自動籠養(yǎng)，因此推測病雞很可能是引種時沒有注重檢測，使得雛雞帶毒，且在生長過程中處于亞臨床感染狀態(tài)，環(huán)境或其他因素使得機體抵抗力降低，從而造成了ALV-J的增殖和廣泛傳播。

臨床和大體剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟和腎臟腫大破裂，輸卵管填充大量黃色干酪狀物質(zhì)；血象學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，成紅細(xì)胞、粒性髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞增多；病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，肝臟和腎臟有粒性髓細(xì)胞的增生，脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)生流失和壞死，表明病雞存在免疫抑制病毒與細(xì)菌的共感染。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，粒性髓細(xì)胞的大量增生引起肝臟和腎臟的腫大破裂，ALV-J引起的免疫抑制導(dǎo)致大腸桿菌的致病性增強，而大腸桿菌的原發(fā)感染使得機體處于免疫功能低下的狀態(tài)，從而導(dǎo)致ALV-J由亞臨床感染到大量暴發(fā)的過程，進(jìn)一步降低了機體的免疫功能，從而增強了兩者的致病性，說明兩者之間存在相互增強的關(guān)聯(lián)。驗證試驗發(fā)現(xiàn)，通過將分離到的大腸桿菌液腹腔接種3只1日齡SPF雞，發(fā)現(xiàn)雛雞精神狀態(tài)良好，采食飲水正常，僅1只雛雞排白色稀狀糞便，這表明ALV-J與大腸桿菌的共感染增強了大腸桿菌的致病性。

近年來禽病的發(fā)生和流行特點往往表現(xiàn)為多種病原混合感染的現(xiàn)象[8-13]。臨床生產(chǎn)中需要重視和加強免疫抑制病毒和細(xì)菌病的防控。目前未有有效的疫苗預(yù)防ALV-J的發(fā)生，防控該病的關(guān)鍵是加強對免疫抑制性病毒的檢測，不斷剔除雞群中陽性雞，從而實現(xiàn)種群凈化[14]。除了加強對免疫抑制性病毒的檢測外，還應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，做好預(yù)防雛雞的早期感染，嚴(yán)格執(zhí)行消毒制度，避免雞群發(fā)生繼發(fā)感染，提高雞群的抵抗力等措施[14-17]。

4 結(jié)論

本研究分別從臨床觀察、大體剖檢、血象學(xué)、病理組織學(xué)、病原學(xué)、細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)等角度對病雞進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測分析，確診該病雞群為ALV-J與大腸桿菌混合感染，對于禽大腸桿菌和ALV-J之間是否存在一定的規(guī)律和相互增強致病的關(guān)聯(lián)性還需后續(xù)進(jìn)一步研究。