血細胞形態(tài)分析系統(tǒng)初步研究與實現(xiàn)

李硯 劉國燁 王志強

【摘要】目的：現(xiàn)有數(shù)字化血細胞形態(tài)分析系統(tǒng)已經(jīng)實現(xiàn)了自動拍攝細胞圖像，用預(yù)訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將細胞圖像預(yù)分類。然而，此類血細胞類型預(yù)分類能力仍有待改進，對血片圖像的解讀與診斷分析仍離不開經(jīng)驗豐富的檢驗技師。且黑盒系統(tǒng)存在敏感數(shù)據(jù)泄露風(fēng)險，個性化定制升級困難。方法：分析研究現(xiàn)有系統(tǒng)現(xiàn)狀，提出了在細胞圖像采集階段使用算力要求低的形態(tài)學(xué)算法提取細胞圖像數(shù)據(jù)，快速獲得大量數(shù)據(jù)后，在高性能服務(wù)器上訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)細胞分類計數(shù)輔助形態(tài)學(xué)復(fù)檢。結(jié)果：該系統(tǒng)自動化細胞樣本圖像采集過程，減少人工細胞圖像提取過程帶來的巨大人工成本，提高了血細胞分割準確性，訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)初步實現(xiàn)了白細胞分類。結(jié)論：本系統(tǒng)可用于血液形態(tài)學(xué)的教學(xué)、培訓(xùn)、質(zhì)量評測等，對比現(xiàn)有國外商業(yè)化系統(tǒng)存在差距但實現(xiàn)了白細胞分類等部分功能，為建立血細胞樣本庫，進行血細胞形態(tài)學(xué)分析，提供了一個具備可行性的自主解決方案。

【關(guān)鍵詞】細胞形態(tài)分析系統(tǒng);細胞分類;顯微圖像處理

【中圖分類號】Q33 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2026-5328（2021）08-004-03

引言

血細胞形態(tài)分析對確診某些疾病至關(guān)重要，傳統(tǒng)上血液學(xué)疾病診斷的金標(biāo)準是人工鏡檢染色外周血涂片進行形態(tài)學(xué)分析。但是人工鏡檢費事費力，需要不斷進行人員培訓(xùn)，高度依賴檢驗技師的形態(tài)學(xué)知識，鏡檢結(jié)果受主觀因素影響較大。此外，由于血涂片標(biāo)本儲藏的限制，不便于檢驗結(jié)果審驗和回溯。因此需要數(shù)字化細胞形態(tài)分析系統(tǒng)，自動化外周血片血細胞形態(tài)學(xué)分析，協(xié)助檢驗技師進行外周血細胞或體液細胞的顯微鏡檢和分析工作。

隨著數(shù)字成像和信息技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了許多自動進行血細胞形態(tài)分析的方法，最新數(shù)字化細胞形態(tài)分析系統(tǒng)已經(jīng)實現(xiàn)了自動拍攝細胞圖像，用預(yù)訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將細胞圖像預(yù)分類[1]。例如：（1） CellaVision DM9600、CellaVision DM1200、CellaVision DC-1; （2） HemaCAM; （3） Sysmex DI-60等。[2]

目前，大多數(shù)數(shù)字化細胞形態(tài)分析系統(tǒng)主要集成了掃碼槍、數(shù)字攝像頭、光學(xué)顯微鏡、計算機系統(tǒng)。通過玻片上的條碼或二維碼作為索引和LIS系統(tǒng)關(guān)聯(lián)，能自動化拍攝細胞圖像。用戶僅需給染好色的血片滴上油，機器自動完成后續(xù)工作，將油滴在玻片上均勻推開，先用X10低倍物鏡在玻片上搜索細胞進行定位、計數(shù)，然后自動轉(zhuǎn)換到X200高倍物鏡拍攝單個細胞照片，最后將獲取到的圖片數(shù)據(jù)輸入到預(yù)訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中計算出分類預(yù)測結(jié)果。[3]

雖然國外數(shù)字化細胞形態(tài)分析系統(tǒng)發(fā)展至今成果豐富。但目前，此類軟、硬件以及文件格式尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準，現(xiàn)有系統(tǒng)識別細胞類型的能力還有待進一步提高，對血片圖像的解讀與診斷分析仍離不開經(jīng)驗豐富的高年資檢驗技師[4]。此外，對于用戶個性化定制需求，廠商系統(tǒng)難以完全滿足且定制升級功能成本高。本研究目標(biāo)是最大化利用醫(yī)院常用的現(xiàn)有儀器設(shè)備，自主實現(xiàn)血細胞形態(tài)分析系統(tǒng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)算法和深度學(xué)習(xí)算法，提取染色外周血涂片中血細胞圖像建立數(shù)據(jù)集，并訓(xùn)練深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行白細胞分類計數(shù)。未來進一步實現(xiàn)對其他血細胞的分類識別，將分類結(jié)果和某種疾病建立相關(guān)性，為臨床提供參考滿足醫(yī)療、教學(xué)、科研中的實際需求。

1 方法

1.1流程設(shè)計

本研究以白細胞自動分類為例，在細胞樣本采集階段，采用普通PC和顯微鏡相結(jié)合的方式，使用數(shù)字光學(xué)顯微鏡采集到樣本圖像后，在PC端運行形態(tài)學(xué)算法將圖像上的白細胞從背景中分離出來預(yù)分類后集中上傳到數(shù)據(jù)庫，通過人工審查修改數(shù)據(jù)庫中預(yù)分類白細胞圖像，審查后的數(shù)據(jù)集輸入到高性能服務(wù)器上訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)算法模型分類白細胞圖像。

訓(xùn)練好的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將白細胞預(yù)分類為嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，單核細胞，淋巴細胞。最后計算各類細胞所占的百分數(shù)供參考，本系統(tǒng)最終要實現(xiàn)自動化血細胞圖像采集及細胞形態(tài)學(xué)分析，利用醫(yī)院現(xiàn)有網(wǎng)絡(luò)，檢驗技師可遠程協(xié)作審查預(yù)分類結(jié)果，糾正錯誤的分類，發(fā)揮集體智慧和專家作用，快速做出準確檢驗結(jié)果。

1.2 形態(tài)學(xué)算法分割

本研究采用了形態(tài)學(xué)算法將白細胞和背景分離出來，這個分割過程基于使用閾值和分水嶺算法，在血涂片上包圍每個細胞元素。此外，利用白細胞的一些典型特征，如大小，形狀，顏色等，區(qū)別白細胞和其他細胞。在細胞圖像采集階段，隨機選擇多名不同性別及年齡的病人外周血樣本，檢驗科技師使用希森美康sp1000i推片機和瑞氏-吉姆薩染液對血液樣本進行自動推片染色。奧林帕斯cx31顯微鏡使用100倍油鏡進行圖像采集，圖像保存到相連的電腦中。多名血液學(xué)專家共同分類，使用標(biāo)注軟件VGG Image Annotator標(biāo)注白細胞建立驗證數(shù)據(jù)集，用于分類結(jié)果的準確度。由于原始圖像較大，所有圖像拆分為350*350px左右并增強對比度，保存為jpeg格式以節(jié)約內(nèi)存和處理時間，避免圖像有更多細節(jié)導(dǎo)致分水嶺算法過度分割。

從外周血樣本中分割出白細胞圖像。閾值，分水嶺和基本特征比較等形態(tài)學(xué)算法用于分割，結(jié)果表明綜合使用這些技術(shù)初步實現(xiàn)了分割效果。白細胞的胞漿和胞核不同類別有不同的顏色，為了從背景中分離出白細胞，實驗發(fā)現(xiàn)紅色通道有最佳的背景和血細胞對比度，包括白細胞和紅細胞以及血小板。當(dāng)使用藍色通道時，白細胞不夠明顯。使用綠色通道時白細胞細胞質(zhì)的顏色接近于紅細胞顏色。為了獲得二值化圖像，對紅色通道使用Otsu二值化。再使用分水嶺算法，從原始的圖像中分割出不同的對象。為了從分水嶺算法所獲得的眾多二值化遮罩中找出代表白細胞的二值化遮罩，進一步分割處理提取出白細胞圖像。創(chuàng)建一個邊框包裹住每個細胞，由于白細胞相對于圖像上的其他細胞或污漬有著獨特的大小，顏色。綜合顏色平均值，邊框縱橫比這兩個特征，通過和其他細胞比較獲得閾值，在閾值內(nèi)的就是白細胞。

1.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練

VGG網(wǎng)絡(luò)的組成規(guī)律是，連續(xù)使用數(shù)個相同的填充為1、窗口形狀為3*3的卷積層，后接上一個歩幅為2，窗口形狀是2*2的最大池化層組成卷積塊。卷積層保持高寬不變，池化層則減半。卷積塊接在一起，再連接幾個全連接層最終構(gòu)成VGG網(wǎng)絡(luò)。由卷積層構(gòu)成的模塊充分抽取空間特征，再以由全連接層構(gòu)成的模塊輸出分類結(jié)果。

VGG11網(wǎng)絡(luò)由八個卷積層，卷積層后跟著最大池化層，最后是三個全連接層組成。細胞圖片輸入網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過梯度下降優(yōu)化算法不斷縮小預(yù)測值和實際值間的誤差，并后向傳播更新權(quán)重系數(shù)，最終預(yù)測圖像分類。

本研究中請檢驗技師按照白細胞分類標(biāo)準，將前期形態(tài)學(xué)算法分割獲取的4431個白細胞圖像，再進一步審核標(biāo)注分為五類：中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，淋巴細胞，單核細胞和嗜堿性粒細胞。其中，嗜堿性粒細胞52個，嗜酸性粒細胞174個，淋巴細胞1586個，單核細胞576個，中性粒細胞2043個。由于數(shù)據(jù)樣本分布嚴重不均衡，為了防止過擬合，對樣本進行隨機的裁剪，旋轉(zhuǎn)，高斯模糊，水平和垂直翻轉(zhuǎn)，擴充樣本數(shù)據(jù)集。

訓(xùn)練VGG11網(wǎng)絡(luò)使用的測試服務(wù)器硬件配置i5 8400CPU，8GB內(nèi)存，和8GB顯存的RTX2070顯卡。該服務(wù)器運行Win10操作系統(tǒng)，安裝配置了訓(xùn)練深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所需軟件，包括有Python 3.6.8，TensorFlow-gpu 1.12.0，Keras 2.1.6等。實際生產(chǎn)環(huán)境深度學(xué)習(xí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練在高性能服務(wù)集群上進行，可采用更加復(fù)雜的算法模型，充分利用高性能服務(wù)器的大內(nèi)存和高算力。深度算法模型完成訓(xùn)練后，用戶提交待分類血涂片圖像，先在客戶端完成細胞分割后，服務(wù)端經(jīng)過圖像特征提取預(yù)分類，返回用戶端顯示預(yù)測結(jié)果。

2結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)算法分割結(jié)果

圖1顯示了應(yīng)用分水嶺算法分割圖像后的結(jié)果，包括白細胞，紅細胞，血小板和污漬等相當(dāng)多數(shù)量的細胞以及雜質(zhì)也被分離出來，但圖像中只有兩個白細胞。

使用400張包含白細胞總數(shù)為414個的圖像檢驗該方法分割白細胞的準確率。實驗中準確分割的定義是分離出的白細胞包含完整的胞核和胞質(zhì)，不包含任何完整的紅細胞、血小板或其他成分。

實驗結(jié)果淋巴細胞被更好地分割，由于淋巴細胞的胞質(zhì)和胞核通常都聚攏在一起，使得分水嶺算法容易分割出來其所在區(qū)域。然而，嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的分割表現(xiàn)較差，有的分割較好，有的卻被忽略了細胞的一部分。嗜酸性紅色的細胞漿使用分水嶺算法被分割為許多區(qū)域，需要進一步研究。白細胞分割的初步結(jié)果，從外周血樣本中分割出白細胞圖像。閾值，分水嶺和基本特征比較等形態(tài)學(xué)算法被用于分割，結(jié)果表明綜合使用這些技術(shù)初步實現(xiàn)了細胞分割提取效果。

2.2 深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)分類結(jié)果

在從未參與模型訓(xùn)練的樣本中隨機抽取白細胞圖像，使用訓(xùn)練后的深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)預(yù)分類，發(fā)現(xiàn)分類存在錯誤，把淋巴細胞錯誤分類為嗜酸性粒細胞，將嗜中性粒細胞錯誤分類為淋巴細胞等。雖然在模型訓(xùn)練階段，在驗證數(shù)據(jù)集上模型達到了95%的準確率，但是模型對從未“見過”的數(shù)據(jù)分類表現(xiàn)好，才表明模型泛化能力強。深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練要根據(jù)數(shù)據(jù)集圖像樣本狀況，選擇復(fù)雜度適配的模型。若模型復(fù)雜度高，容易出現(xiàn)過擬合，模型復(fù)雜度低，容易出現(xiàn)欠擬合。

由于本次使用中的數(shù)據(jù)集規(guī)模小，訓(xùn)練集樣本數(shù)量比模型的參數(shù)量少，所以容易發(fā)生過擬合。數(shù)據(jù)量有限，最終訓(xùn)練得到的精度測試精度再高，實際分類準確度也達不到應(yīng)用需求。這也是需要建立細胞圖像庫的原因之一，訓(xùn)練模型一般使用小批量隨機梯度下降算法，基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)不斷迭代更新模型參數(shù)，使得模型逐步擬合訓(xùn)練數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果，使得模型預(yù)測結(jié)果和真實結(jié)果不斷接近。

實驗中隨機初始化模型參數(shù)，使用4431個白細胞圖像訓(xùn)練優(yōu)化分類輸出結(jié)果后，另篩選出各類白細胞典型形態(tài)細胞圖像，再次訓(xùn)練模型后，用未參與訓(xùn)練數(shù)據(jù)測試，發(fā)現(xiàn)模型對白細胞分類的準確率提高到了80%。

3討論

使用手動顯微鏡進行細胞分類計數(shù)是形態(tài)學(xué)診斷的“金標(biāo)準”。因此，在疾病篩查與診治的過程中，細胞形態(tài)學(xué)分析是臨床實驗室必不可少的，在復(fù)檢血液細胞分析結(jié)果中的應(yīng)用最為突出[5]。本研究提出的血細胞形態(tài)分析系統(tǒng)，使用形態(tài)學(xué)算法結(jié)合深度學(xué)習(xí)算法，利用院內(nèi)現(xiàn)有的PC機、服務(wù)器、存儲及網(wǎng)絡(luò)設(shè)備，對外周血涂片進行形態(tài)學(xué)分析實現(xiàn)細胞分類等。在模型算法的訓(xùn)練階段，油鏡下采集染色血涂片圖像，在和顯微鏡攝像頭相連的PC機上運用形態(tài)學(xué)算法分割提取細胞圖像并預(yù)分類。分類結(jié)果經(jīng)專業(yè)人員審核確認后，上傳到數(shù)據(jù)庫用于訓(xùn)練深度學(xué)習(xí)算法。在模型預(yù)測階段，PC機分割提取圖像后，使用服務(wù)器上訓(xùn)練過的深度學(xué)習(xí)算法進行預(yù)分類，結(jié)果由專業(yè)人員審核，得到最終的血細胞形態(tài)學(xué)分析結(jié)果。

本研究以白細胞圖像提取、分類驗證了方案的可行性。對計算機性能要求低的形態(tài)學(xué)算法被用于分離血細胞圖像和背景，在高性能服務(wù)器上使用獲取的圖像數(shù)據(jù)來擬合深度學(xué)習(xí)算法模型。訓(xùn)練深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)，需要大量血細胞圖片作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)。手動標(biāo)注細胞圖像費時費力，通過形態(tài)學(xué)算法分割提取細胞并預(yù)分類，檢驗技師審核預(yù)分類結(jié)果，并可重新分類血細胞。通過院內(nèi)現(xiàn)有網(wǎng)絡(luò)可實現(xiàn)多點多地協(xié)同工作，不需要檢驗技師到標(biāo)本所在的實驗室，就能隨時隨地溯源評審檢驗圖像。每位檢驗技師的形態(tài)學(xué)方面知識程度不同，對于有疑問的細胞，多名檢驗技師可以共同商討一致得出分析結(jié)果。

在教培方面促進學(xué)習(xí)和能力提升。與傳統(tǒng)的顯微鏡下結(jié)合圖片講義的教學(xué)模式相比，系統(tǒng)可以運用數(shù)據(jù)庫中收集的海量細胞圖像數(shù)據(jù)，將細胞不同發(fā)育階段的時期特點進行區(qū)別比較，有利于培養(yǎng)學(xué)生對外周血的整體認知。無須像傳統(tǒng)方法一樣重新制片、染色和鏡檢，隨機抽取數(shù)據(jù)庫圖像用于形態(tài)學(xué)圖像識別考核，省時、省力、高效提高實驗室質(zhì)量管理，能夠更加客觀地反映人員能力缺陷所在，通過有的放矢地加強形態(tài)學(xué)圖譜培訓(xùn)可以針對性地提高形態(tài)學(xué)識別能力。

深度學(xué)習(xí)用數(shù)據(jù)來擬合模型，關(guān)鍵是數(shù)據(jù)的質(zhì)量和數(shù)量，訓(xùn)練數(shù)據(jù)質(zhì)量高，數(shù)量多，一般訓(xùn)練出來的模型能輸出更準確的預(yù)測結(jié)果。算法模型本身隨著技術(shù)的進步不斷推陳出新，且有很多開源的深度學(xué)習(xí)算法，相對積累獲得高質(zhì)量訓(xùn)練數(shù)據(jù)，獲得算法相對簡單。國外現(xiàn)有的數(shù)字化全自動血細胞形態(tài)分析儀，由涂片機械掃描裝置和安裝了血細胞分析算法的計算機組成，雖然已發(fā)展很長時間且功能多，但是國外系統(tǒng)完全黑盒，醫(yī)療影像數(shù)據(jù)安全性差，可能造成敏感數(shù)據(jù)泄露，系統(tǒng)更新升級不能完全自主，不能完全滿足醫(yī)院科研的個性化需求。以本領(lǐng)域領(lǐng)先的CellaVision 系統(tǒng)為例，其采集的細胞圖像與顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)仍存在一定差距，尤其在對細胞核染色質(zhì)細微結(jié)構(gòu)與質(zhì)地的顯示上，采集的細胞圖像缺乏立體感，清晰度欠佳。各種幼粒細胞會混淆，受染色影響誤判，造成分類錯誤等。預(yù)分類結(jié)果必須經(jīng)人工審核，也需要不斷擴充標(biāo)本庫，對各種細胞識別的分類準確度才能提高。而本系統(tǒng)由醫(yī)院完全掌握內(nèi)部算法和數(shù)據(jù)，隨著圖像數(shù)據(jù)的積累和算法不斷優(yōu)化，分類準確度也會進一步提高。以此為基礎(chǔ)還可挖掘出更多運用，推進醫(yī)教研發(fā)展。

本研究雖然測試了血涂片白細胞分類，但是所提出方案也適用于其他醫(yī)學(xué)顯微圖像，比如人體體液細胞或組織細胞等樣本的更多項目，例如紅細胞預(yù)分類，體液白細胞分類，血小板聚集等。

4結(jié)論

本研究提出一種基于醫(yī)院現(xiàn)有設(shè)備實現(xiàn)自主可控的血細胞形態(tài)分析系統(tǒng)，并通過染色血涂片圖像細胞分割和白細胞分類驗證了該方案的可行性。有助于建立血細胞圖像資源庫，推動形態(tài)學(xué)算法和深度學(xué)習(xí)算法在醫(yī)院醫(yī)教研中的應(yīng)用和普及。最終將實現(xiàn)實驗室從推片、染色、掃描、審核血涂片全流程的標(biāo)準化，推動實驗室建立自己的復(fù)檢規(guī)則，通過完備可回溯的存檔數(shù)據(jù)資料加強院內(nèi)協(xié)作，通過引入創(chuàng)新的自動化，數(shù)字成像，深度學(xué)習(xí)算法等技術(shù)幫助實驗室提升運營效率，讓檢驗分析過程更快，更靈活，更準確。

實驗中也存在很多不足，如樣本量少，沒有比較更多的算法等，其他研究者采用別的方法或?qū)崿F(xiàn)比目前方法更好的結(jié)果，未來工作將繼續(xù)探索，找出更加符合血細胞識別的算法，滿足輔助實驗室復(fù)檢的實際需求。

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基金項目：南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展資金資助項目（YKK18168）