藥食同源材料組合中二氫楊梅素水提工藝優(yōu)化

張榮彬 高文明 戴志勇 陳振桂 任國(guó)譜

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.英氏控股集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

藥食同源材料組合是根據(jù)宋代醫(yī)學(xué)家錢(qián)乙《小兒藥證直訣》著名方劑“導(dǎo)赤散”加減而來(lái)，試驗(yàn)所用搭配及比例為：藤茶(30%)、桑葉(15%)、菊花(15%)、蘆根(10%)、麥芽(10%)、甘草(10%)以及淡竹葉(10%)。

藤茶作為類(lèi)茶植物已被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，其有效成分為黃酮類(lèi)物質(zhì)(如蛇葡萄素、二氫楊梅素、楊梅素、福建茶素、龍涎香醇、β-谷甾醇、楊梅黃素和楊梅苷等)，具有降低體內(nèi)寒氣、清除燥熱、降低血壓與血脂并保護(hù)肝臟的作用[1-3]，其提取方法主要有水提法、醇提法、微波輔助萃取法以及超聲提取法等[4]。桑葉的成分有黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、脂類(lèi)、生物堿、揮發(fā)油、植物甾醇和綠原酸等[5]，其提取方法主要有熱水、醇和稀堿等溶劑提取法；超聲輔助乙醇提取桑葉黃酮類(lèi)化合物耗時(shí)少且增效明顯[6]。菊花主要含有黃酮類(lèi)、多糖、揮發(fā)油和氨基酸等成分[7]；其黃酮類(lèi)成分中二氫楊梅素可采取醇解法和熱水提取[8]。蘆根具有清熱生津、除煩、止嘔和利尿的作用；蘆根含有糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、酚類(lèi)、甾體類(lèi)、小分子酚酸以及揮發(fā)性成分[9]等，可用水煎和醇沉淀法提取[10]。麥芽中含有較多功能性纖維素，如富含谷胺酰胺的蛋白質(zhì)纖維素，可以治療潰瘍性結(jié)腸炎[11]，采用水提可發(fā)揮助消化作用，也可用90%乙醇回流提取[12]。甘草是一種補(bǔ)益中草藥，其甘草總黃酮是甘草抗炎活性組分之一，而異甘草素是甘草總黃酮抗炎的活性成分[13]；藥用成分主要包括甘草黃酮、甘草酸、甘草多糖和甘草次酸等，可用溶劑提取法、超聲輔助提取法或者微波輔助提取法等進(jìn)行提取[14]。淡竹葉的化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、酚性成分、有機(jī)酸、氨基酸和糖類(lèi)等[15]，可用水和甲醇提取或60%的乙醇回流提取[16]。

近年來(lái)，針對(duì)二氫楊梅素物質(zhì)提取研究大多集中于單一物質(zhì)材料，并未見(jiàn)對(duì)藥食同源材料組合的提取研究。目前關(guān)于二氫楊梅素大多使用乙醇進(jìn)行浸提[17-19]，也有使用丙酮[20]、超聲波[21]和酶法[22]進(jìn)行提取的，而用熱水提取也可以達(dá)到一定的效果[23-26]，并且所用藥食同源材料組合中各味藥中的有效成分大都可以溶于熱水且傳統(tǒng)中藥多為水煎，無(wú)有機(jī)溶劑的殘留，在食品工業(yè)中能保證一定的安全性，在成本控制方面也具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。研究擬采用熱水回流提取法提取藥食同源材料組合中的二氫楊梅素，并優(yōu)化其提取工藝，旨在為藥食同源材料開(kāi)發(fā)及浸膏粉的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶、蘆根、麥芽、甘草、淡竹葉、桑葉和菊花：桑植縣華遠(yuǎn)生物科技有限公司；

二氫楊梅素：濃度>98%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；

磷酸、甲醇、乙腈：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters e2695型，美國(guó)Waters公司；

電子分析天平：CP114型，上海奧豪斯儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-5200DV型，昆山市超聲儀器有限公司；

三用恒溫水箱：HH-600型，金壇市神科儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：WGL-125B型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 取藥食同源材料組合65 g，進(jìn)行篩選除雜，選擇m藤茶∶m桑葉∶m菊花∶m蘆根∶m麥芽∶甘草∶m淡竹葉=30%∶15%∶15%∶10%∶10%∶10%∶10%，即藤茶19.5 g，桑葉、菊花各9.75 g，蘆根、麥芽、甘草以及淡竹葉各6.5 g。

1.3.2 二氫楊梅素含量的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[27—28]并修改，具體操作：

(1)樣品處理：取篩選除雜后的藥食同源材料組合65 g，按照試驗(yàn)方案，加水浸泡，進(jìn)行回流提取，過(guò)濾后收集、合并提取液，并將其定容至1 000 mL容量瓶后混勻，移取提取液各1 mL，置于5 mL EP管中，加入3 mL甲醇，搖勻，用0.45 μm微孔薄膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

(2)色譜條件：選用色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈—水—磷酸(V乙腈∶V水∶V磷酸=15∶85∶0.1)，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

(3)對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取12.0 mg二氫楊梅素置于25 mL容量瓶中，加少量甲醇，超聲溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為48.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，根據(jù)色譜條件，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液，記錄其二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品色譜。

(4)進(jìn)樣操作：精密吸取對(duì)照品溶液10 μL與供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 浸膏得率測(cè)定 取提取液25 mL于干燥至恒重的蒸發(fā)皿，恒溫水浴(90±5)℃蒸干，105 ℃下干燥3 h，干燥器中冷卻30 min，稱(chēng)重后按(1)式計(jì)算浸膏得率。

(1)

式中：

C——浸膏得率，%；

m1——蒸發(fā)皿與提取液質(zhì)量，g；

m2——蒸發(fā)皿質(zhì)量，g；

m3——提取液蒸干、干燥后質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

(1)提取次數(shù)對(duì)二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：稱(chēng)取藥食同源材料組合65 g，加水浸泡1 h，加熱回流提取3次，第1次加水體積為其質(zhì)量的8倍提取1.5 h，第2次和第3次加水體積為其質(zhì)量的6倍并提取1.0 h，提取結(jié)束后對(duì)提取液進(jìn)行收集，共3份提取液。將3份提取液分別定容至1 000 mL且混合均勻后各取適量，液相色譜法測(cè)定二氫楊梅素提取量，并計(jì)算浸膏得率。

(2)浸泡時(shí)間對(duì)二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取藥食同源材料65 g，加水浸泡0.5，1.0，1.5，2.0 h，加熱回流提取2次，第1次加水體積為其質(zhì)量的8倍提取1.5 h，第2次加水體積為其質(zhì)量的6倍提取1.0 h，提取結(jié)束后對(duì)提取液進(jìn)行收集，共3份提取液，將其定容至1 000 mL并混合均勻，液相色譜法測(cè)定二氫楊梅素提取量，并計(jì)算浸膏得率。

(3)加水量對(duì)二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取藥食同源材料65 g，加水浸泡1.0 h，加熱回流提取2次，第1次加水體積分別為其質(zhì)量的6，8，10，12倍提取1.5 h，第2次加水體積分別為其質(zhì)量的4，6，8，10倍提取1.0 h，提取結(jié)束后對(duì)提取液進(jìn)行收集，共3份提取液，將其定容至1 000 mL并混合均勻，液相色譜法測(cè)定二氫楊梅素提取量，并計(jì)算浸膏得率。

(4)提取時(shí)間對(duì)二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取藥食同源材料65 g，加水浸泡1.0 h，加熱回流提取2次，第1次加水體積為其質(zhì)量的8倍分別提取1.0，1.5，2.0，2.5 h，第2次加水體積為其質(zhì)量的6倍分別提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，提取結(jié)束后對(duì)提取液進(jìn)行收集，共3份提取液，將其定容至1 000 mL并混合均勻，液相色譜法測(cè)定二氫楊梅素提取量，并計(jì)算浸膏得率。

1.3.5 正交試驗(yàn) 采用L9(34)正交表，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇浸泡時(shí)間、加水量和提取時(shí)間為考察因素，考察指標(biāo)為二氫楊梅素提取量和浸膏得率。

綜合評(píng)分時(shí)需參考各指標(biāo)的最大值，數(shù)據(jù)用歸一化處理，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)需根據(jù)各指標(biāo)影響作用大小分析不同權(quán)重，其公式為：

(2)

式中：

Z——綜合評(píng)分；

M1——二氫楊梅素提取量，mg；

M2——最大二氫楊梅素提取量，mg；

C1——浸膏得率，%；

C2——最大浸膏得率，%。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 20.0軟件與Ecxel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，采用Origin 2019進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取次數(shù) 藥食同源材料組合中二氫楊梅素易溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，但因考慮到藥食同源材料組合中各材料多為水煎，并考慮到安全性及未來(lái)可能會(huì)在嬰幼兒產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用采用熱水提取。由表1可知，對(duì)65 g藥食同源材料組合進(jìn)行第1次提取時(shí)，二氫楊梅素提取量為2 910.26 mg，浸膏得率為17.40%；隨著提取次數(shù)的增加，二氫楊梅素提取量從第2次的825.61 mg降為260.09 mg，浸膏得率從7.60%下降到4.10%。

表1 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響

提取次數(shù)對(duì)藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量具有重要影響。二氫楊梅素提取量會(huì)隨著提取次數(shù)的增加而升高，但第3次提取時(shí)二氫楊梅素提取量已明顯低于前2次提取，原因可能是藥食同源材料組合中二氫楊梅素的提取在前2次提取時(shí)已達(dá)飽和，可能熱水并沒(méi)有有機(jī)溶劑對(duì)植物細(xì)胞壁持續(xù)強(qiáng)穿透及活性物質(zhì)溶解作用，導(dǎo)致其二氫楊梅素提取量不會(huì)因提取次數(shù)增加而過(guò)多變化，提取次數(shù)的增加雖會(huì)增加其提取量，但對(duì)后續(xù)提取效果已無(wú)顯著影響，并無(wú)實(shí)際意義，反而增加成本和負(fù)擔(dān)，故試驗(yàn)采取2次即可滿(mǎn)足提取要求。

2.1.2 浸泡時(shí)間 由圖1可以看出，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量和浸膏得率有逐漸升高的趨勢(shì)；二氫楊梅素提取量從2 565 mg增長(zhǎng)為3 056 mg，浸膏得率從20.5%增長(zhǎng)為25.8%；分析各階段的增長(zhǎng)率可知，二氫楊梅素提取量的增長(zhǎng)率在逐漸變小，由8.97%減小至4.77%，而浸膏得率的增長(zhǎng)率逐漸變大，由4.04%增加到11.02%。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)提取效果的影響

二氫楊梅素提取量增加是因?yàn)殡S著浸泡時(shí)間的增加，藥食同源組合材料會(huì)充分與熱水接觸，熱水會(huì)對(duì)植物細(xì)胞壁造成破壞，從而導(dǎo)致二氫楊梅素的浸出；二氫楊梅素提取量的增長(zhǎng)率降低是因?yàn)闊崴畬?duì)植物細(xì)胞壁破壞效果有限，熱水的破壞效果達(dá)到閾值，細(xì)胞內(nèi)外二氫楊梅素提取量達(dá)到平衡，導(dǎo)致二氫楊梅素浸出的速率開(kāi)始降低，所以二氫楊梅素提取量的增長(zhǎng)率降低。浸膏得率升高是因?yàn)樯Ｈ~、菊花、麥芽、甘草與淡竹葉在熱水條件下，二氫楊梅素浸出的同時(shí)其自身水溶性物質(zhì)會(huì)因熱水而浸出[28]，因此會(huì)使浸膏得率增加，故浸泡1.5 h即可滿(mǎn)足要求。

2.1.3 加水量 由圖2可以看出，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量和浸膏得率隨加水量的增加有逐漸升高的趨勢(shì)，二氫楊梅素提取量從2 345 mg增長(zhǎng)到3 498 mg，浸膏得率從22.5%增長(zhǎng)到25.5%；此外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素提取量的升高趨勢(shì)比浸膏得率大，但二者的增長(zhǎng)率卻都在不斷減小，前者由22.64%減小至4.32%，后者由6.67%減小至2.00%。因?yàn)殡S著加水量的增加，熱水積溫效果會(huì)使水溫更好地維持在一定范圍內(nèi)，增加的熱水量越多，水溫下降速度越慢，所以在一定范圍內(nèi)增大加水量會(huì)有利于二氫楊梅素和一些水溶性物質(zhì)的快速浸出，而且提取液中水溶性成分及雜質(zhì)也會(huì)變多，但隨著熱水增加，料液比會(huì)逐漸升高，當(dāng)加水量為10倍/8倍時(shí)，提取效果已不再明顯。

圖2 加水量對(duì)提取效果的影響

同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果還表明，當(dāng)加水量為6倍/4倍時(shí)，溶液黏度較高，或因料液比太低所致，且對(duì)二次提取產(chǎn)生不利影響。因此，加水量為10倍/8倍時(shí)即可滿(mǎn)足要求。

2.1.4 提取時(shí)間 由圖3可以看出，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，提取量從2 635 mg增長(zhǎng)到2 952 mg，二氫楊梅素提取量的增長(zhǎng)率逐漸減小，由6.19%減小至1.37%；浸膏得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，從21.5%增長(zhǎng)到27.5%；浸膏得率的增長(zhǎng)率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)基本保持一致，并無(wú)明顯波動(dòng)；二氫楊梅素提取量的增長(zhǎng)率的降低一方面是因?yàn)殡S提取時(shí)間的延長(zhǎng)，二氫楊梅素浸出后與熱水接觸時(shí)間變長(zhǎng)，熱水的高溫導(dǎo)致二氫楊梅素發(fā)生氧化作用，導(dǎo)致其提取量降低；另一方面是隨著提取時(shí)間變長(zhǎng)，所得提取液會(huì)形成膠狀溶液，導(dǎo)致其過(guò)濾及后續(xù)操作損失嚴(yán)重。因此需要選擇合適提取時(shí)間。浸膏得率的增長(zhǎng)率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)基本保持一致且無(wú)明顯波動(dòng)，是因?yàn)楦邷刈饔每梢允顾苄晕镔|(zhì)逐步溶解浸出，彌補(bǔ)了提取時(shí)間延長(zhǎng)過(guò)程中二氫楊梅素的氧化損失，所以浸膏得率也緩慢增大。因此，提取時(shí)間為1.5 h/1.0 h即可滿(mǎn)足要求。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

2.2 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇浸泡時(shí)間、加水量和提取時(shí)間為考察因素，考察指標(biāo)為二氫楊梅素提取量和浸膏得率。

試驗(yàn)采用L9(34)正交表，所選因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序?yàn)锽(加水量)>A(浸泡時(shí)間)>C(提取時(shí)間)，得到最優(yōu)方案為A1B3C2。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4方差分析結(jié)果表明：加水量的變化會(huì)影響二氫楊梅素提取量，且優(yōu)于浸泡時(shí)間和提取時(shí)間，加水量對(duì)藥食同源材料組合中二氫楊梅素的提取效果有顯著影響(P<0.05)，浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)提取效果無(wú)顯著影響。因此，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果得到水提工藝的最優(yōu)條件為A1B3C2，即藥食同源材料組合加水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次加水體積為其質(zhì)量的10倍提取1.5 h，第2次加水體積為其質(zhì)量的8倍提取1.0 h。

表4 方差分析結(jié)果?

稱(chēng)取3份65 g的藥食同源材料組合，根據(jù)得到的正交試驗(yàn)最優(yōu)選擇對(duì)提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。表5試驗(yàn)結(jié)果顯示優(yōu)選出的最佳方案A1B3C2具有良好的重現(xiàn)性，表明此提取工藝條件合理、穩(wěn)定、可操作性強(qiáng)。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

采用熱水浸提法提取藥食同源材料組合藤茶中二氫楊梅素的最優(yōu)條件為加水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次加水體積為其質(zhì)量的10倍提取1.5 h，第2次加水體積為其質(zhì)量的8倍提取1.0 h。在此最佳條件下，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量為3 761.14 mg，浸膏得率為31.42%，綜合評(píng)分為99.47，該工藝可滿(mǎn)足藥食同源材料組合中二氫楊梅素的提取要求且大大提高提取效率。

試驗(yàn)彌補(bǔ)了過(guò)往只對(duì)單一物質(zhì)材料研究提取的空白，而且熱水浸提生產(chǎn)成本低，無(wú)有機(jī)溶劑殘留，安全性高，藥食同源材料中提取物大多為中藥成分，可應(yīng)用于嬰幼兒輔助食品。在后續(xù)研究中應(yīng)充分對(duì)藥食同源材料的功能性和適用性進(jìn)行深入研究，亦可根據(jù)不同應(yīng)用領(lǐng)域探究適合的提取方法以及分離純化，充分發(fā)揮藥食同源材料這一寶貴的資源。