p33ING1、PDGF?A及bFGF在ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

郭清

白內(nèi)障為晶狀體發(fā)生混濁，阻礙光線進(jìn)入眼內(nèi)，從而對(duì)視力造成影響的一種眼?。?］。年齡相關(guān)性白內(nèi)障（age?related cataract，ARC）發(fā)生頻率較高，是導(dǎo)致老年人盲目的主要原因［2］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)對(duì)晶狀體的相關(guān)化學(xué)成分、含量和代謝進(jìn)行了大量研究，但迄今為止有關(guān)ARC 的發(fā)病機(jī)制仍未完全清晰。生長(zhǎng)抑制因子1（inhibitor of growth 1，INGl）定 位 于 人 染 色 體13q33?34，其編碼的蛋白產(chǎn)物為核蛋白［3］。INGlmRNA 有INGla、INGlb、INGlc 多種不同的變位剪接模式，編碼著p47INGla，p33INGlb，p24INGlc三種不同的蛋白質(zhì)［4］。有研究認(rèn)為p33INGl的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)由“血清饑餓"誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但關(guān)于其與ARC 的關(guān)系鮮有報(bào)道［5］。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ba?sic fibroblast growth factor，bFGF）存在于多種動(dòng)物和人的眼組織中，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其與白內(nèi)障關(guān)系密切［6］。血小板源性生長(zhǎng)因子A（Platelet derived growth factor?A，PDGF?A）作為一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生分泌的活性多肽，與多種眼科疾病的關(guān)系一直是臨床關(guān)注焦點(diǎn)［7］。本研究就p33ING1、PDGF?A 及bFGF 在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選取2018年4月至2019年4月本院收治的67例ARC 患者作為ARC 組，其中男37 例，女30 例，平均年齡（69.31±5.44）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合ARC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］：①年齡在50 歲及以上者；②使用晶狀體混濁分級(jí)系統(tǒng)Ⅱ（lens opacity classifica?tion system Ⅱ，L0CS Ⅱ）［8］確定為皮質(zhì)型晶狀體混濁、核型晶狀體混濁和后囊下型晶狀體混濁，并排除對(duì)視力無(wú)影響的點(diǎn)狀混濁；③日常生活視力在0.7 以下；④白內(nèi)障手術(shù)后人工晶狀體和無(wú)晶狀體眼者或患者雙眼中有1 眼滿足ARC 診斷標(biāo)準(zhǔn)也可診斷為ARC。⑤納入研究前1 個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)影響激素水平、免疫功能的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①視力下降原因包括角膜疾病、眼底疾病等的患者；②精神系統(tǒng)異常者；③依從性差者。

對(duì)照組選取同期來(lái)院進(jìn)行準(zhǔn)分子激光屈光性角膜切削術(shù)治療的近視者70 例，39 例，女31 例，平均年齡（68.45±5.41）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①眼部功能無(wú)異常，無(wú)任何眼部疾??；②最佳矯正視力在0.5 及以上者；③晶狀體無(wú)混濁。所有標(biāo)本的采集均獲得患者本人同意并簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。ARC 組與對(duì)照組基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 晶狀體上皮細(xì)胞前處理

采用連續(xù)環(huán)形撕囊法取下ARC 組和對(duì)照組人晶狀體直徑約為5 mm 內(nèi)的前囊膜，95%NaCl 溶液沖洗好后，置于EP 管，保存于-80℃冰柜中備用。

1.2.2 p33ING1、PDGF?A 及bFGF 檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法進(jìn)行檢測(cè)：取上述液氮保存的晶狀體上皮細(xì)胞組織，按照Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取組織總RNA，按照miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix 試劑說(shuō)明配反應(yīng)體系并加樣。RT q?PCR 反應(yīng)體系共為20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，雙蒸水ddH2O 6.0 μL。完成后將其放入熒光定量PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95℃5 s，95℃15 s，60℃30 s，72℃15 s，共41 個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后整理數(shù)據(jù)，并對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct 值進(jìn)行分析，采用2ΔCt［14］算法計(jì)算p33ING1、PDGF?A及bFGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量［9］。

1.3 氧化應(yīng)激因子水平測(cè)定

取出提前備好的標(biāo)本，分離3 mm×3 mm，加入磷酸緩沖液（pH 7.3），渦旋震蕩，-4℃環(huán)境下進(jìn)行離心。檢測(cè)指標(biāo)為丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxi?dase，GSH?Px），檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2。結(jié)果

2.1 ARC 組與對(duì)照組p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達(dá)比較

ARC 組p33ING1表達(dá)水平低于對(duì)照組，PDGF?A及bFGFmRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of p33ING1，PDGF?A and bFGF mRNA expression levels between 2 groups（±s）

表1 兩組p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of p33ING1，PDGF?A and bFGF mRNA expression levels between 2 groups（±s）

組別ARC 組對(duì)照組t 值P 值n 67 70 p33ING1 mRNA 0.44±0.13 0.87±0.21 14.335<0.001 PDGF?A mRNA 1.06±0.25 0.54±0.13 15.368<0.001 bFGF mRNA 265.62±15.18 134.09±14.07 52.627<0.001

2.2 ARC 組與對(duì)照組氧化應(yīng)激水平比較

ARC 組GSH?Px 水平低于對(duì)照組，MDA 水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 ARC 組與對(duì)照組氧化應(yīng)激水平比較（±s）Table 2 Comparison of oxidative stress level between arc group and control group（±s）

表2 ARC 組與對(duì)照組氧化應(yīng)激水平比較（±s）Table 2 Comparison of oxidative stress level between arc group and control group（±s）

組別ARC 組對(duì)照組t 值P 值n 67 70 MDA（μmol/mg）18.09±2.34 6.98±1.13 35.624<0.001 GSH?Px（μmol/g）0.36±0.04 0.87±0.08 46.869<0.001

2.3 ARC 患者p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達(dá)與氧化應(yīng)激水平的相關(guān)性

ARC 患者p33ING1mRNA 表達(dá)與GSH?Px 水平呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與MDA 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）；PDGF?A及bFGFmRNA 表達(dá)水平與GSH?Px 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與MDA 水平呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 ARC 患者p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達(dá)與氧化應(yīng)激水平的相關(guān)性分析Table 3 Correlation Analysis of p33ING1，PDGF?A and bFGF mRNA expression and oxidative stress level in patients with ARC

3 討論

ARC 發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，雖然通過(guò)手術(shù)能很好地使該癥患者恢復(fù)視力，但是在疾病發(fā)展和治療過(guò)程中，可導(dǎo)致多數(shù)患者的生活質(zhì)量明顯下降。同時(shí)由于手術(shù)潛在的風(fēng)險(xiǎn)也給患者帶來(lái)了嚴(yán)重的身心負(fù)擔(dān)，因此更全面更深入地探討該病的病因及防治方法顯得尤為迫切［10］。晶狀體接受外界環(huán)境影響最早的部位是位于晶狀體前囊下的晶狀體上皮細(xì)胞，當(dāng)此類(lèi)細(xì)胞發(fā)生改變的同時(shí)也會(huì)誘發(fā)晶狀體發(fā)生改變，相關(guān)學(xué)者認(rèn)為ARC 的發(fā)生與此類(lèi)細(xì)胞的改變有很大程度的關(guān)聯(lián)性［11?12］。

在一例紫外線、H2O2及鈣離子載體引導(dǎo)的白內(nèi)障晶狀體離體實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了晶狀體上皮細(xì)胞中存在著大量的凋亡細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)有力地佐證了晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡可能是各種白內(nèi)障發(fā)生的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)這一理論［13］。p33ING1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種生長(zhǎng)抑制基因，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［14］。研究發(fā)現(xiàn)，p33ING1表達(dá)受抑制將增加NIH3T3 細(xì)胞的集落形成、延長(zhǎng)二倍體成纖維細(xì)胞的生存時(shí)間［15］。而p33ING1表達(dá)下調(diào)則可抑制細(xì)胞凋亡，控制細(xì)胞生長(zhǎng)速度，并促進(jìn)細(xì)胞逃離生長(zhǎng)監(jiān)控，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增生而發(fā)生病變。本研究中可見(jiàn)ARC 患者晶狀體上皮細(xì)胞中p33ING1mRNA 呈低表達(dá)，p33ING1mRNA 與GSH?Px 水平呈正相關(guān)，與MDA 水平呈負(fù)相關(guān)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致［16］。提示p33ING1mRNA 可能參與ARC 晶體混濁的過(guò)程。

PDGF?A 是功能最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子之一，其通過(guò)自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)，對(duì)多種疾病的進(jìn)展至關(guān)重要，并與患者不良預(yù)后相關(guān)。文獻(xiàn)指出，正常人房水內(nèi)PDGF?A 主要功能是維持晶狀體上皮細(xì)胞的正常增殖和分化，為晶狀體實(shí)現(xiàn)正常功能提供基礎(chǔ)［17］。本研究中，ARC 患者PDGF?A水平高于對(duì)照組，PDGF?A水平與GSH?Px 水平呈負(fù)相關(guān)，與MDA 水平呈正相關(guān)。PDGF?A 通過(guò)影響晶狀體上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)，而一旦PDGF?A 濃度發(fā)生異常，其將發(fā)揮有絲分裂作用導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞不正常的增殖［18?19］。因此，可以推測(cè)PDGF?A的水平及分布不正常很可能是導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生異變，導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的原因之一。

本研究結(jié)果中，ACR 患者晶狀體上皮細(xì)胞中PDGF?AmRNA 水平的表達(dá)顯著升高，且PDGF?AmRNA 表達(dá)水平與GSH?Px 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與MDA 水平呈正相關(guān)關(guān)系，可見(jiàn)PDGF?AmRNA 與ARC 的發(fā)生關(guān)系密切，并發(fā)揮了重要作用。晶狀體代謝過(guò)程中會(huì)通過(guò)多種方式分泌一些細(xì)胞因子，彌補(bǔ)氧化應(yīng)激對(duì)其造成的傷害，進(jìn)而為細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化提供支持，在這些細(xì)胞因子中p33ING1、PDGF?A及bFGFmRNA 的價(jià)值和地位不容小覷，三者有望成為評(píng)價(jià)ACR 發(fā)生、病情進(jìn)展的標(biāo)志性指標(biāo)。

綜上所述，p33ING1、PDGF?A及bFGFmRNA 水平在ARC 患者晶狀體上皮細(xì)胞中呈異常表達(dá)，三者水平與ARC 患者氧化應(yīng)激呈明顯相關(guān)性，檢測(cè)其水平有利于臨床病情評(píng)估。