系統(tǒng)性紅斑狼瘡患兒中性粒細(xì)胞亞群與外周血自噬相關(guān)基因Beclin1表達(dá)水平相關(guān)性

劉志明 郜苗苗 邵麗麗 朱翠敏 劉秀芬

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythemato?sus，SLE）是一種對(duì)患者全身多個(gè)系統(tǒng)和器官都能產(chǎn)生影響的自身免疫性疾病，多通過影響心血管而導(dǎo)致患者死亡，兒童SLE 情況比成人少，但其后果往往更為嚴(yán)重，表現(xiàn)出更多的并發(fā)癥和更高的死亡率，預(yù)后更差［1?2］。SLE 作用機(jī)制復(fù)雜，可能與感染、紫外線照射、免疫調(diào)節(jié)異常及遺傳等多種因素相關(guān)，加之兒童特殊的生理狀態(tài)，治療上存在很多困難和挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療方法只能緩解病情，至今尚無特效治療手段［3?4］。因此，探討SLE 的發(fā)病機(jī)理對(duì)該病的診斷與治療具有較廣泛的意義。中性粒細(xì)胞在SLE 發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色［5］，其亞型低密度粒細(xì)胞（low density granulocyte，LDGs）最初由Hacbarth 發(fā)現(xiàn)存在于SLE 成人患者外周血單核細(xì)胞（PBMCs）制備物中，后續(xù)相繼從鼠和豬的血液中能分離到LDGs，在特定狀態(tài)下，其釋放防御素、蛋白酶、促炎因子及抗菌肽的能力提升，刺激內(nèi)皮細(xì)胞受損并釋放出更多的腫瘤壞死因子、IL?6、IL?8 及干擾素（IFNs）［6?7］。而自噬相關(guān)基因Beclin1（Autophagy related gene Beclin1，Beclin1）是自噬重要的調(diào)控因子，在調(diào)控自噬體合成方面具有重要作用［8］。由此說明LDGs 和Beclin1 在SLE 的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在相互作用，但目前未見二者關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究以SLE 患兒為研究對(duì)象，探討LDGs 與其外周血Beclin1 表達(dá)的相關(guān)性，以期找到影響兒童SLE 的新的標(biāo)志物。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年01月至2019年12月期間就診本院兒科的確診為SLE 的患兒56 例為研究對(duì)象（SLE組），其中男性10 例，女性46 例，年齡平均（11.26±2.38）歲。另選取同期年齡、性別匹配的健康體檢兒童25例作為對(duì)照組，其中男性6例，女性19例，年齡平均（11.42±2.43）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，所有受試者或家屬均充分知情并簽署知情同意書。

SLE 組入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ARC）修訂的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；②年齡小于18 周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他免疫或風(fēng)濕性相關(guān)疾病者；②患有肝臟疾病、糖尿病或其他血脂紊亂疾病者；③不能按照方案要求配合研究者。另外，通過SLE 活動(dòng)度評(píng)分表（SLEDAI）對(duì)SLE 活動(dòng)性進(jìn)行評(píng)分［10］，總分超過9 分，則認(rèn)為SLE 處于活動(dòng)期，反之，則為非活動(dòng)期。結(jié)果有32 例SLE 患兒處于活動(dòng)期，剩余24 例為非活動(dòng)期。

1.2 試劑和儀器

Ficoll?Hypaque 人淋巴細(xì)胞分離液（生產(chǎn)廠家：天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?；Trizol（生產(chǎn)廠家：lnvitrogen 公司）；高容量cDNA 逆轉(zhuǎn)錄Kti（200 Reactions）（生產(chǎn)廠家：Applied Biosystems）；熒光定量PCR 目標(biāo)基因和內(nèi)參GAHDP（Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，Invitrogen 公司合成）；PCR 擴(kuò)增系統(tǒng)（購自Applied Biosystems）。

1.3 標(biāo)本收集及人外周血單核細(xì)胞（PBMC）分離

清晨空腹條件下，以含有二胺四乙酸（EDTA?K2）抗凝劑的采集管采集所有研究對(duì)象采集外周靜脈血2m1，應(yīng)用Ficoll?Hypaqu 并按照操作說明，采取密度梯度離心法分離PBMC，并采用貼壁法去除PBMC，收集剩余的淋巴細(xì)胞，用于總RNA 的提取。

1.4 總RNA 提取

在液氮中進(jìn)行細(xì)胞研磨使其呈粉末狀，加入Trizol 1 mL，于室溫下放置5 min；加入氯仿0.2 mL并混合均勻后，于4℃，12 000 r/min 條件下離心10分鐘，取最上層溶液約500 μL，置于另一離心管中，每1 mL Trizol 試劑加入0.5 mL 異丙醇，室溫放置20 min 后，4℃，12 000 r/min 再次離心10 min，棄上清液；加入提前預(yù)冷的75%乙醇1 mL，混合均勻后，4℃，12 000 r/min 離心3 分鐘，棄上清液，干燥5到10 min 后，加入約20～50 μL DPEC 水溶解；通過紫外分光光度法檢測(cè)RNA 溶液的濃度和純度。

1.5 Beclin1 基因表達(dá)測(cè)定

1.5.1 反應(yīng)體系

配制含有5×gDNA Eraser Buffer、gDNA Eraser及總RNA 的反應(yīng)混合液，再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中，最后加入RNA 樣品，于42℃作用2 min 或室溫5 min，即得RNA 反應(yīng)液；冰浴條件下，取RNA 反應(yīng)液10 μL，分別加入RT Primer Mix、Prime Script RT Enzyme Mix I 各1 μL 及5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，最后加入雙蒸水使總量為20 μL，37℃，反應(yīng)條件為15 min，85℃5 s，4℃循環(huán)。

1.5.2 實(shí)時(shí)定量RT?PCR

目的基因和內(nèi)參GAPDH 分別擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，二者反應(yīng)體系和條件相同。擴(kuò)增序列見表1。反應(yīng)體系：Sybergreen 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA1.5 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃，2 min；95℃，15s，60℃，1 min，40個(gè)循環(huán)；所得產(chǎn)物保存于4℃條件。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定，通過內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行均一化處理后，計(jì)算ΔCT 值。

表1 擴(kuò)增系列Table 1 Amplification series

1.5.3 PCR 產(chǎn)物半定量分析

于電泳槽中加入1.5%瓊脂糖凝膠及0.5×TBE電泳液至超過膠面。然后取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，加入2 μL 6×loading Buffer 并混合均勻后注入凝膠孔內(nèi)。接通電極，當(dāng)上樣緩沖液中的澳酚藍(lán)遷移至DNA 片段分離的合適距離時(shí)（耗時(shí)約40 min），關(guān)閉電源。取出凝膠，用數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，計(jì)算Beclin1 的相對(duì)密度值，代表其mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 實(shí)驗(yàn)室相關(guān)參數(shù)

血常規(guī)參數(shù)主要包括白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血紅蛋白等；風(fēng)濕免疫參數(shù)主要包括抗dsDNA 抗體、ANA 抗體、抗Sm 抗體和APL 陽性；以及補(bǔ)體C3、LDGs 及SLEDAI 評(píng)分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；組間計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson 相關(guān)進(jìn)行相關(guān)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒基本參數(shù)比較

SLE 組患兒 的LDGs 比例、抗dsDNA 抗 體比例、SLEDAI 評(píng)分及Beclin1 均明顯高于對(duì)照組，補(bǔ)體C3 水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組患兒的血常規(guī)參數(shù)、ANA 抗體、抗Sm抗體和APL 陽性比例，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 兩組患兒基本參數(shù)比較［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of basic parameters between 2 groups［（±s），n（%）］

表2 兩組患兒基本參數(shù)比較［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of basic parameters between 2 groups［（±s），n（%）］

參數(shù)白細(xì)胞（×109/L）中性粒細(xì)胞（×109/L）淋巴細(xì)胞（×109/L）血小板（×109/L）血紅蛋白（g/L）抗dsDNA 抗體ANA 抗體抗Sm 抗體APL 陽性補(bǔ)體C3（g/L）LDGs 比例（%）SLEDAI（分）Beclin1 SLE 組（56 例）3.40±1.23 5.21±3.22 1.26±0.68 84.18±21.45 93.08±19.12 33（58.93）52（92.86）19（33.93）17（30.36）0.54±0.12 12.26±3.08 8.95±2.23 1.52±0.54對(duì)照組（25 例）3.69±1.47 5.06±3.11 1.52±0.79 91.32±24.20 96.83±20.12 7（28.00）20（80.00）9（36.00）7（28.00）1.06±0.26 3.70±1.18 7.58±1.78 0.90±0.32 t/χ2值0.922 0.196 1.511 1.330 0.802 6.614 2.893 0.033 0.046 9.556 18.042 2.708 6.428 P 值0.359 0.845 0.135 0.187 0.425 0.010 0.089 0.856 0.830<0.001<0.001 0.008<0.001

2.2 不同活動(dòng)分期患兒參數(shù)比較

活動(dòng)期SLE 患兒的補(bǔ)體C3 水平較非活動(dòng)期患兒低，而LDGs 比例、抗dsDNA 抗體比例、SLEDAI 評(píng)分及Beclin1 均高于非活動(dòng)期患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 不同活動(dòng)分期患兒參數(shù)比較［（±s），n（%）］Table 3 Comparison of parameters of children with different activity stages［（±s），n（%）］

表3 不同活動(dòng)分期患兒參數(shù)比較［（±s），n（%）］Table 3 Comparison of parameters of children with different activity stages［（±s），n（%）］

組別活動(dòng)期非活動(dòng)期t/χ2值P 值n 32 24補(bǔ)體C3（g/L）0.44±0.12 0.68±0.18 5.657<0.001 LDGs 比例（%）14.35±3.67 9.47±2.25 6.139<0.001抗dsDNA抗體23（71.88）9（37.50）5.171 0.023 SLEDAI（分）9.58±2.74 8.11±1.72 2.457 0.017 Beclin1 1.81±0.72 1.14±0.35 4.59<0.001

2.3 各參數(shù)間相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)可知，SLE 患兒的LDGs 比例與SLEDAI 評(píng)分及Beclin1 呈正相關(guān)（P<0.05），與補(bǔ)體C3、抗dsDNA 抗體則無明顯相關(guān)性（P>0.05）。見表4。

表4 各參數(shù)間相關(guān)性分析Table 4 Correlation Analysis among parameters

3 討論

盡管SLE 患者生存率已明顯提高，但其長(zhǎng)期經(jīng)受病情遷延反復(fù)的折磨，身心健康都嚴(yán)重受損，而目前尚無SLE 根治方法［11］。SLE 具有明顯的地域差異，可能與遺傳、種族及環(huán)境等有關(guān)；而兒童SLE 較成年患者具有更高的疾病活動(dòng)度、更早的臟器受累和更多的免疫抑制劑應(yīng)用，可能是兒童SLE 患者病死率高的原因［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)LDGs、抗dsDNA 抗體比例升高及補(bǔ)體C3 水平下降是兒童患SLE 的表現(xiàn)特征。而活動(dòng)期SLE 患兒的補(bǔ)體C3 水平較非活動(dòng)期患兒低，LDGs 比例、抗dsDNA 抗體比例、SLEDAI 評(píng)分均高于非活動(dòng)期患兒；提示LDGs 可能是影響SLE活動(dòng)的關(guān)鍵因素。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，83%的LDGs水平升高的SLE 患者出現(xiàn)血管炎、滑膜炎等皮膚受累典型癥狀；LDGs 數(shù)量的增加，可能是SLE 患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的基礎(chǔ)［8，13］。這均說明LDGs 是活動(dòng)性SLE 的重要標(biāo)志物。其作用機(jī)制還不清楚，可能是［14］：①LDGs 通過釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs），在抗菌的同時(shí)導(dǎo)致患者自身免疫性疾病的發(fā)生；②LDGs 是IFNs 的促進(jìn)劑，而IFNs 在SLE 發(fā)病中具有重要作用，且IFN?α 可反過來使LDGs 殺死內(nèi)皮細(xì)胞和合成IFN?α 的能力得到增強(qiáng)。但相關(guān)性分析中，SLE 患兒的LDGs 比例與SLEDAI 評(píng)分相關(guān)性較弱，可能與研究納入的病例數(shù)相對(duì)較少有關(guān)，有待更進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

自噬受多種基因調(diào)控，不同病理狀態(tài)下表現(xiàn)不同［15］。Beclin1 是自噬的必要標(biāo)志之一，約有40%～70%的散發(fā)性卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌患者缺失Beclin1 等位基因，而Beclin1 的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可激發(fā)細(xì)胞的自噬功能，抑制腫瘤細(xì)胞系的成瘤性［16］。研究證明，SLE 患者的外周血淋巴細(xì)胞中Beclin1 表達(dá)上調(diào)，尤以活動(dòng)期SLE 更為顯著。本研究結(jié)果與上述研究相符，提示Beclin1 可能在兒童SLE 的活動(dòng)中發(fā)揮一定作用，但未發(fā)現(xiàn)Beclin1與SLEDAI 的明顯相關(guān)性，可能與樣本數(shù)相對(duì)偏少有關(guān)。另外，SLE 患兒的LDGs 與Beclin1 呈正相關(guān)，推測(cè)可能與NETs 的形成有關(guān)，SLE 狀態(tài)刺激下，LDGs 通過多條不同通路釋放NETs，其中就包括自噬，而Beclin1 則是重要的自噬基因［6］。有研究通過曲美他嗪抑制小鼠自噬功能，可減少其NETs 生成［17］。但關(guān)于LDGs 與Beclin1 的相關(guān)研究報(bào)道仍較少，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上，SLE 患兒LDGs 和Beclin1 表達(dá)水平顯著升高，二者在SLE 的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在相互作用，臨床可加以利用，或可為SLE 治療提供新的途徑。但本研究因納入樣本較少，未能深入闡明LDGs 和Beclin1 間作用機(jī)制，有待后續(xù)更大規(guī)模、更加深入的研究。