良惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR表達(dá)差異及與患者預(yù)后的關(guān)系

呂蘇一 張磊 李山成

腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（Pheochromocytoma，PCC）是腎上腺較為常見(jiàn)腫瘤，由于其良、惡性具有相似臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，故鑒別難度較大，嚴(yán)重影響臨床制定針對(duì)性治療方案及預(yù)后改善［1?3］。因此，準(zhǔn)確鑒別腎上腺PCC 性質(zhì)是目前臨床亟需解決的問(wèn)題。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最為強(qiáng)烈的血管通透性因子，可誘導(dǎo)新生血管生成，參與腎細(xì)胞癌［4］、宮頸癌［5］等多種惡性腫瘤病理進(jìn)程。黑色素A（melanA）是惡性黑色素瘤特異性免疫指標(biāo)，在腎細(xì)胞癌中呈低表達(dá)。另有研究表明［6］，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和自噬調(diào)控中亦起著重要作用。HOX 基因的反義基因間RNA（HOX transcript anti?sense intergenic RNA，HOTAIR）是第一個(gè)臨床發(fā)現(xiàn)的lncRNA，具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)作用，在肝癌［7］、胃癌［8］等增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中的作用已被臨床證實(shí)。本研究嘗試探討良惡性PCC 患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)差異及對(duì)患者預(yù)后的影響，旨在為臨床診治、預(yù)后評(píng)估提供潛在途徑。報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年2月至2020年2月肥城查莊礦醫(yī)院腎內(nèi)科收治的69 例惡性PCC 為惡性組，33 例良性PCC 為良性組，采集手術(shù)切除的良惡性PCC 組織標(biāo)本。其中惡性組男42 例，女27 例，平均年齡（43.82±3.04）歲；良性組男20 例，女13 例，平均年齡（44.19±2.85）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①兩組均經(jīng)手術(shù)病理組織學(xué)確診；②所有研究對(duì)象均簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前有放化療、激素治療史者；②合并心腦等其他重要臟器器質(zhì)性損害者；③合并自身免疫系統(tǒng)疾病或全身感染性疾病者；④合并其他部位惡性腫瘤者；⑤語(yǔ)言與聽(tīng)力功能障礙或精神行為異常者。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

采集手術(shù)切除的良惡性PCC 組織標(biāo)本（3 cm×3 cm）：①使用中性福爾馬林（4%）固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，首先采用抗體染，出現(xiàn)棕色，后用蘇木素染核染藍(lán)色。采用免疫組織化學(xué)法試劑盒檢測(cè)VEGF、melanA 表達(dá)。結(jié)果判定［9］：每張切片均由具備豐富經(jīng)驗(yàn)的2 名病理醫(yī)師根據(jù)染色范圍與染色強(qiáng)度評(píng)分進(jìn)行判斷，VEGF、melanA 陽(yáng)性均以高倍顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜產(chǎn)生棕黃色或棕褐色顆粒沉著為準(zhǔn)，其中染色范圍分為1 分、2 分、3 分、4 分；染色強(qiáng)度分為0 分（與背景接近）、1 分（稍微高于背景色）、2 分（顯著超過(guò)背景色）、3 分（出現(xiàn)深棕黃色）。染色范圍、染色強(qiáng)度評(píng)分結(jié)果相加，0～3 分為陰性，>3 分為陽(yáng)性。②采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒檢測(cè)LncRNA HOTAIR 表達(dá)，根據(jù)Ct 值判定檢測(cè)結(jié)果，其中Ct 值<26 為陽(yáng)性，26≤Ct 值<29 為弱陽(yáng)性，Ct 值≥29 為陰性。

1.2.2 治療方法

PCC 患者行腹腔鏡手術(shù)治療，惡性患者手術(shù)切除腫瘤后4 周接受輔助治療或化療。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)與惡性組病理特征的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)系數(shù)模型；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)對(duì)良惡性腎上腺PCC 的鑒別價(jià)值分析采用受試者工作特征（ROC）曲線；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)與惡性腎上腺PCC 患者1年生存率的關(guān)系采用卡普蘭?邁耶曲線（KM）法分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組VEGF、melanA、LncRNAHOTAIR陽(yáng)性表達(dá)

惡性組VEGF、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性表達(dá)率高于良性組，melanA 陽(yáng)性表達(dá)率低于良性組（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 良惡性腎上腺PCC 患者VEGF、melanA 表達(dá)（SP，×400）Figure 1 The expression of VEGF in patients with benign and malignant adrenal PCC was detected（SP，×400）

表1 兩組VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性率比較［n（%）］Table 1 Comparison of the positive expression of VEGF，Melania and lncrna hotair between 2 groups［n（%）］

2.2 惡性組不同臨床資料患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性表達(dá)比較

惡性組不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤體積患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；惡性組不同臨床分期、分化程度、浸潤(rùn)程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 惡性組不同臨床病理特征患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性表達(dá)比較［n（%）］Table 2 Comparison of positive expression of VEGF，Melania and lncrna hotair in patients with different clinicopathological characteristics in malignant group［n（%）］

2.3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)與惡性組臨床病理特征的相關(guān)性

經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析可知，VEGF、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性表達(dá)與惡性組臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)，melanA 陽(yáng)性表達(dá)與惡性組臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與分化程度呈正相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)與惡性組臨床病理特征的相關(guān)性Table 3 Correlation between expression of VEGF，Melania，lncrna hotair and clinicopathological features of malignant group

2.4 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)對(duì)惡性腎上腺PCC 的鑒別效能

繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 聯(lián)合鑒別惡性腎上腺PCC 的曲線下面積（AUC）為0.919（95%CI：0.848～0.964），敏感度、特異度分別為89.86%、93.94%（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 ROC 曲線Figure 2 ROC curve

2.5 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)與腎上腺PCC 患者1 生存率的關(guān)系

隨訪1年，惡性腎上腺PCC 患者脫落2 例。VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽(yáng)性表達(dá)患者1年生存率低于陰性表達(dá)患者（χ2=7.655，P=0.006；χ2=5.012，P=0.025），melanA 陽(yáng)性表達(dá)患者1年生存率高于陰性表達(dá)患者（χ2=4.724，P=0.030），見(jiàn)圖3。

圖3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達(dá)與腎上腺PCC 患者1 生存率的關(guān)系Figure 3 Relationship between VEGF，Melania，lncrna hotair expression and 1 survival rate in adrenal PCC patients

3 討論

本研究中，惡性PCC 患者VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率高于良性PCC 患者，并與患者臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)性，與分化程度存在負(fù)相關(guān)性。VEGF 可提高微血管通透性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖，加快新生血管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移［10］。

既往研究表明［11］，VEGF 在多種惡性腫瘤尤其是出現(xiàn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤中表達(dá)率超出80.0%。結(jié)合賀亮亮［12］研究考慮上述結(jié)果產(chǎn)生機(jī)制可能在于VEGF 通過(guò)結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面受體，可活化下游信號(hào)通透，直接調(diào)控腫瘤干細(xì)胞形成、增殖等進(jìn)程，同時(shí)，其通過(guò)血管通透性，可介導(dǎo)基質(zhì)溶解、新血管網(wǎng)構(gòu)建、管腔形成等腫瘤血管形成過(guò)程，從而參與惡性PCC 細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程。提示對(duì)存在VEGF高表達(dá)PCC 患者需警惕其存在惡性傾向可能性。

melanA 在血管周細(xì)胞瘤、多數(shù)類固醇腫瘤（包括PCC）及黑色素細(xì)胞病變中表達(dá)，呂祥瑞等［13］通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)可知，惡性PCC 患者melanA 表達(dá)較低，并與患者臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度存在一定相關(guān)性，支持本研究觀點(diǎn)，可見(jiàn)melanA 表達(dá)變化可為PCC 性質(zhì)臨床鑒別提供新的醫(yī)學(xué)思路。推測(cè)提高melanA 表達(dá)可能是阻斷PCC 惡變、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要途徑。

另外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，本研究提出，LncRNA HOTAIR 在惡性PCC 患者中呈高表達(dá)，且與臨床分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，與孫青風(fēng)等［14］研究相似。LncRNA HOTAIR 是一種促癌基因，在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，具有早期鑒別腫瘤、術(shù)后監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)及作為特異藥物治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值［15］。這可能歸因于LncRNA HOTAIR不僅可調(diào)控HOXD 啟動(dòng)子相關(guān)蛋白的組蛋白修飾，激活原癌基因，破壞原癌基因與抑癌基因平衡，還能靶向調(diào)控雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路，提高葡萄糖同型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?1 表達(dá)，強(qiáng)化癌細(xì)胞無(wú)氧糖酵解獲能能力，從而參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)控。說(shuō)明LncRNA HOTAIR 與惡性PCC 發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)系，可能作為惡性PCC 鑒別生物標(biāo)志物，為后續(xù)研究及治療提供新靶點(diǎn)。進(jìn)一步明確證明三者聯(lián)合鑒別惡性PCC 的AUC 為0.919，優(yōu)于單獨(dú)指標(biāo)鑒別，提示三者聯(lián)合有助于提高惡性PCC 鑒別效能，具有一定推廣實(shí)用性。

此外，本研究通過(guò)Log?Rank 檢驗(yàn)還表明，VEGF、LncRNA HOTAIR 高表達(dá)、melanA 低表達(dá)可能降低惡性PCC 患者1年生存率，這可能與VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 異常表達(dá)可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞異常增殖、加劇浸潤(rùn)深度、上調(diào)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而引起不良預(yù)后有關(guān)。由此可見(jiàn)，VEGF、LncRNA HOTAIR 表達(dá)對(duì)惡性PCC 預(yù)后亦具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。但本研究局限性在于納入樣本量小，未分析VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR三者之間相關(guān)性及在PCC 中的具體作用機(jī)制，今后需進(jìn)一步開(kāi)展大樣本研究論證所得結(jié)果。

綜上所述，惡性PCC 患者VEGF、LncRNA HOTAIR 表達(dá)升高，melanA 表達(dá)下降，三者聯(lián)合檢測(cè)可為臨床鑒別PCC 性質(zhì)、評(píng)估病理特征、預(yù)測(cè)預(yù)后提供循證支持。