LINC00634基因在結(jié)直腸癌中表達及與預(yù)后的相關(guān)性分析

馬甜甜 柳家翠 段怡平 陳梁玥 朱翠雯 鄒曉沨

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第四大常見腫瘤，占全世界癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的8.5%。腺癌為CRC 中最常見的病理類型。CRC在我國的發(fā)病率不斷上升，主要與經(jīng)濟發(fā)展帶來的生活方式和環(huán)境的改變有關(guān)，如三高一低（高熱量、高脂肪、高蛋白、低纖維）的西化生活方式［1］。早期CRC 患者的五年生存率可高達90%，由于缺乏早期診斷標志物，大多數(shù)CRC 患者診斷時已處于晚期階段，其五年生存率降至70.4%［2］。因此，尋找CRC 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標志物，對于CRC的診斷、治療及預(yù)后有著重要的意義。人類基因轉(zhuǎn)錄組僅有少數(shù)RNA 可作為蛋白質(zhì)合成的模板，超過70%的RNA 為非編碼RNA，對于細胞蛋白質(zhì)的合成及增殖分化起著非常重要的作用。其中，長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA 稱為長鏈非編碼RNA（Long non?coding RNA，lncRNA）。研究表明，許多l(xiāng)ncRNA 在各種癌癥中表達失調(diào)，并與診斷和預(yù)后有關(guān)，例如，lncRNA HOXA?AS2在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均有異常表達［3］，lncRNA DDX11?AS1在肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中出現(xiàn)高表達［4］。有研究表明，LINC00634通過miR?342?3p/Bcl2L1 軸在食管鱗狀細胞癌中發(fā)揮致癌基因的作用［5］，但是LINC00634在CRC 發(fā)生發(fā)展中的分子機制及與預(yù)后的關(guān)系尚未闡明。本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫，探索LINC00634在CRC 中的表達、免疫浸潤及預(yù)后價值。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載與處理

在TCGA 數(shù)據(jù)庫官方網(wǎng)站（http：//portal.gdc.cancer.gov/）下載結(jié)直腸RNA ?seq（level 3，HTSeq?FPKM）數(shù)據(jù)。其中包括CRC 組織樣本473 例，正常結(jié)直腸組織樣本41 例。對基因表達數(shù)據(jù)進行歸一化處理，并Log2 轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。在TCGA 數(shù)據(jù)庫上下載并提取CRC 患者的臨床病理特征信息，刪除臨床信息缺失的樣本。

1.2 CRC 組織與正常組織之間的差異表達基因

使用R 4.0.2 軟件來篩選差異基因。將得到的差異基因繪制熱圖和火山圖。

1.3 LINC00634表達與臨床病理特征和預(yù)后的聯(lián)系

根據(jù)LINC00634在CRC 患者中表達值得中位數(shù)，將患者分為兩組。利用卡方檢驗分析LINC00634與CRC 患者臨床特征的關(guān)系。利用Kaplan?Meier 法比較兩組之間總體生存的差異。使用Cox 回歸分析LINC00634的預(yù)后價值。

1.4 基因富集分析

采用基因富集分析（gene set enrichment analy?sis，GSEA）分析LINC00634在CRC 發(fā)生發(fā)展中參與的信號通路。從Broad Institute 網(wǎng)站（http：//soft?ware.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）下載GSEA 分析軟件GSEA 4.1.0，分析通路來自Molecular Sig?nature Database（MsigDB）數(shù)據(jù)庫中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集。采用加權(quán)富集法分析，隨機組合次數(shù)設(shè)為1 000 次，所有其他參數(shù)均按默認值設(shè)置。P值小于0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于0.05 的基因集作為顯著富集的基因。

1.5 免疫浸潤分析

使用R 4.0.2 軟件評估LINC00634表達與腫瘤細胞免疫浸潤豐度的相關(guān)性。將473 例腫瘤樣本以中位數(shù)分為高、低表達組分析LINC00634對免疫系統(tǒng)微環(huán)境的影響。通過基于基因表達的反卷積算法CIBERSORT（http：//cibersort.stanford.edu/）評估各組之間基因表達的相對變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用軟件SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析；計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗；Wilcoxon 秩和檢驗，將CRC 患者的年齡、性別、TNM 分期等臨床指標進行量化賦值，利用Cox 比例風(fēng)險回歸模型進行單因素和多因素分析；生存分析采用KM 法；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表達差異基因

篩選差異基因后共得到3 314 個差異表達基因（圖1），其中包含1 933 個上調(diào)基因和1 381 個下調(diào)基因。

圖1 差異表達基因Figure 1 Differentially expressed genes

2.2 LINC00634 在CRC 和正常組織中的表達

CRC 中LINC00634的表達水平與正常組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 LINC00634 在CRC 組織中的表達分析Figure 2 Analysis of LINC00634 expression in colorectal cancer tissues

2.3 LINC00634 表達與CRC 患者臨床病理特征的聯(lián)系

LINC00634的表達水平與患者的年齡、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.05），見表1。臨床Ⅱ期患者LINC00634的表達水平與Ⅲ期患者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3A。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組LINC00634表達水平與未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3B～D。

圖3 LINC00634 表達量與CRC 患者臨床病理特征相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis between LINC00634 expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer patients

表1 LINC00634 表達與CRC 患者臨床特征的相關(guān)性分析［n（%）］Table 1 Correlation analysis between LINC00634 expression and clinical characteristics of colorectal cancer patients［n（%）］

2.4 LINC00634 表達與CRC 患者預(yù)后的關(guān)系

高表達LINC00634組中患者的總體生存率低于低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

圖4 LINC00634 的表達與CRC 患者預(yù)后的關(guān)系Figure 4 Expression and prognosis of LINC00634 in patients with colorectal cancer

年齡、Stage 分期、T 分期、M 分期、N 分期以及LINC00634均可作為預(yù)后因素，多因素Cox 回歸分析提示，年齡、T 分期和LINC00634可以作為CRC患者的獨立預(yù)后因素（P<0.05）。見表2。

表2 單因素和多因素Cox 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis

2.5 GSEA 功能富集分析

使用GSEA 功能富集進一步了解LINC00634在CRC 發(fā)生發(fā)展過程中參與的信號通路，富集結(jié)果。見圖5。

圖5 GSEA 功能富集分析Figure 5 GSEA functional enrichment analysi s

2.6 LINC00634 表達與免疫浸潤

LINC00634表達與CD8+T 細胞、CD4+記憶T細胞、M1 型巨噬細胞和靜止型NK 細胞正相關(guān)（R>0，P<0.05），與嗜酸性粒細胞呈負相關(guān)（R<0，P<0.05），見圖6A。調(diào)節(jié)性T 細胞在LINC00634高表達組中含量增加，而CD4+記憶T 細胞和嗜酸性粒細胞含量減少，見圖6B。相關(guān)性熱圖顯示，在CRC 中，CD8+T 細胞與M0 型巨噬細胞存在顯著的正相關(guān)性，而與CD4+記憶T 細胞存在顯著的負相關(guān)性。見圖6C。

圖6 LINC00634 表達與免疫浸潤Figure 6 Expression of LINC00634 and immune infiltration

3 討論

CRC 是一種發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌、胃癌、肝癌的惡性腫瘤，遺傳和環(huán)境因素對CRC 的發(fā)生發(fā)展有重要的影響［6］。CRC 早期無癥狀，大多數(shù)患者就診時已是晚期，治療及預(yù)后效果不佳。檢測外周血中的循環(huán)腫瘤細胞及其他與癌癥有關(guān)的腫瘤標志物成本相對較低、侵入性更少，有利于CRC 的早期診斷［7］。已有研究表明mSEPT9、環(huán)狀RNA 等在CRC 患者血漿中特異性表達，可作為腫瘤標志物用于CRC 的篩查和早期診斷［8?10］。

本研究結(jié)合多種生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)LINC00634在CRC 組織中表達上調(diào)，其表達水平與患者的年齡、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。KEGG 通路分析表明，上調(diào)的LINC00634主要參與了DNA 復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)，嘌呤、嘧啶核苷酸代謝，磷酸戊糖途徑，TGF 信號通路，ECM 受體相互作用通路等通路。DNA 損傷修復(fù)中核苷酸切除修復(fù)與堿基切除修復(fù)為重要的修復(fù)途徑，其通路中基因表達改變及基因功能的缺失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及大量的病理生理及生化過程，異常的代謝途徑，如嘌呤核苷酸代謝可通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響基因和蛋白的表達，促進細胞惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移［12］，TGF 信號通路參與多種疾病的發(fā)生，包括肝癌、乳腺癌等，ECM1 是一種分泌性糖蛋白，與腫瘤發(fā)生、血管生成和表皮分化等密切相關(guān)，通過與顆粒蛋白前體（PGRN）相互作用參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13］。上調(diào)的LINC00634可能通過上述途徑在CRC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，對癌癥的不良預(yù)后產(chǎn)生影響。

同時，本研究揭示了LINC00634表達與CRC免疫浸潤水平之間的聯(lián)系。不同免疫細胞的基因標志物與LINC00634表達之間的關(guān)系暗示了LINC00634在調(diào)控結(jié)直腸腫瘤免疫微環(huán)境中的重要意義。結(jié)果顯示LINC00634表達與CD8+T 細胞、CD4+記憶T 細胞、M1 型巨噬細胞和靜止型NK 細胞正相關(guān)，而與嗜酸性粒細胞呈負相關(guān)。這揭示LINC00634可能通過調(diào)節(jié)T 細胞與NK 細胞進而影響CRC。研究表明腫瘤的轉(zhuǎn)移與免疫系統(tǒng)相關(guān)，T 細胞免疫功能失衡的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移［14］，轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者體內(nèi)Th17 細胞增加，可以促進腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的耐受［15］?？梢酝茢?，LINC00634過表達可以促進T 細胞與NK 細胞的免疫反應(yīng)和浸潤，進而影響CRC 的轉(zhuǎn)移與預(yù)后。

綜上所述，LINC00634在CRC 組織中表達顯著上調(diào)，調(diào)節(jié)了CRC 發(fā)生發(fā)展過程中免疫浸潤細胞及各種途徑中的蛋白質(zhì)，并與CRC 患者的惡性進展相關(guān)，提示CRC 患者的不良總體生存預(yù)后，可以作為CRC 患者的獨立預(yù)后因素。LINC00634有望成為CRC 新型分子標志物和腫瘤治療的分子靶點。