豬骨氮摻雜碳量子點(diǎn)制備及其用于檢測(cè)Co2+

錢 玟， 何 利， 潘無雙， 陳燕華， 王 惠， 劉書亮， 陳姝娟， 劉愛平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 四川 雅安 625014)

1 引 言

碳量子點(diǎn)(Carbon quantum dots，CQDs)是一類尺寸小于10 nm具有量子限域效應(yīng)的新型零維碳納米材料[1]，與金屬納米團(tuán)簇和傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，CQDs由于其低毒性[2]、更寬的光致發(fā)光光譜[3]和高熒光穩(wěn)定性[4]等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可被開發(fā)為具有快速、選擇性好、靈敏度高和低毒性等出色性能的熒光探針，用于選擇性檢測(cè)有害物質(zhì)。

鈷離子(Co2+)是人體必需的一種微量元素，可以促使紅細(xì)胞和部分酶的合成、調(diào)節(jié)酶和輔助因子的催化活性，在人體中起著重要作用[5-6]。但是，過量攝入Co2+會(huì)使機(jī)體內(nèi)的自由基過剩，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使人患上哮喘、鼻炎、過敏性皮炎和心肌病等疾病[7]。考慮到Co2+引起的毒性作用，世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中Co2+的限量為40 μg/L[8]。現(xiàn)有的CQDs檢測(cè)Co2+方法大多以化學(xué)物質(zhì)為前體，對(duì)環(huán)境及人體健康造成一定的危害，且量子產(chǎn)率較低。田等[9]以化學(xué)物質(zhì)對(duì)苯二胺和天冬酰胺為原料，通過一步水熱法合成了綠色熒光的N-CQDs，用于檢測(cè)Co2+及生物成像，但量子產(chǎn)率僅為15.5%。京等[10]以丙烯酸碳源，乙二胺為氮源，采用水熱法制備了N-CQDs，量子產(chǎn)率為22.7%。因此，以生物質(zhì)材料為碳源，采用簡(jiǎn)單、快速、可控的水熱法合成高熒光CQDs，成為了分析檢測(cè)研究的熱點(diǎn)。

我國(guó)是世界上禽、畜產(chǎn)量最多的國(guó)家之一， 2018年中國(guó)豬肉總產(chǎn)量為5 400萬噸，約占全球產(chǎn)量的50%，若以豬骨占豬肉的9%～14%計(jì)算[11]，我國(guó)年均產(chǎn)生486～756萬噸豬骨。然而，除排骨和腔骨可直接用于飲食而被大量需求外，其他骨頭的利用率均不高，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境危害。由于豬骨富含脂肪與蛋白質(zhì)等物質(zhì)，可作為制備碳量子點(diǎn)的良好碳源，因此本文以生物質(zhì)廢棄物豬骨(棒子骨)、乙二胺為前驅(qū)體，采用綠色經(jīng)濟(jì)的水熱法合成豬骨氮摻雜碳量子點(diǎn)(N-CQDs)，通過各種表征技術(shù)研究了N-CQDs的結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)，探究了N-CQDs的穩(wěn)定性，建立了一種快速檢測(cè)Co2+的碳量子點(diǎn)熒光分析方法，并用于實(shí)際樣品中Co2+的檢測(cè)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

試劑：豬骨(棒子骨)收集于中國(guó)雅安蒼坪山農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)(將豬骨剔除碎肉洗凈后，置于60 ℃烘箱中烘干，然后用粉碎機(jī)研磨成粉末狀，100目過篩保存?zhèn)溆?。乙二胺、CoCl2、KCl、ZnCl2、BaCl2、MgCl2、NaCl、CdCl2、CaCl2、NiCl2、FeCl3、CuCl2、HgCl2、AlCl3、MnCl2、CrCl3、硝酸溶液均購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司(中國(guó)成都)。硫酸奎寧購(gòu)自邁坤化工有限公司(中國(guó)上海)。其他化學(xué)藥品和溶劑均購(gòu)自萬科試劑有限公司(中國(guó)雅安)，所有試劑均為分析純。

儀器：Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；Lumina熒光分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；NICOLETiS10 型傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；TEM-2100透射電子顯微鏡(日本LJEMOC)；Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)；Shimadzu D/Max-2500 X射線衍射儀(日本島津公司)等。

2.2 N-CQDs制備

本實(shí)驗(yàn)采用水熱法制備綠色生物質(zhì)豬骨氮摻雜碳量子點(diǎn)。制備方法如下：將骨粉與乙二胺混合在60 mL去離子水中攪拌均勻，然后將混合物轉(zhuǎn)移到100 mL四氟乙烯內(nèi)膽 Teflon反應(yīng)釜中，并在烘箱中恒溫加熱，待反應(yīng)液冷卻得到黃褐色溶液。離心(4 000 r/20 min)后用0.22 μm濾膜過濾除去大顆粒雜質(zhì)得到N-CQDs溶液，在4 ℃冰箱中避光保存?？疾旆磻?yīng)溫度(160，180，200，220，240 ℃)、反應(yīng)時(shí)間(8，10，12，14，16 h)、骨粉量(4，5，6，7，8 g)和乙二胺量(0.6，0.7，0.8，0.9，1 mL)對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響，確定最佳制備條件。

2.3 N-CQDs表征

TEM-2100透射電子顯微鏡進(jìn)行形貌特征分析；Lumina熒光分光光度計(jì)測(cè)量N-CQDs的熒光光譜；NICOLETiS10 型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定N-CQDs表面官能團(tuán)；XRD-6000X射線衍射光譜儀測(cè)定XRD 譜圖；Shimadzu D/Max-2500 X射線衍射儀測(cè)定XPS譜圖；MAZ2012馬爾文粒度儀測(cè)定Zeta電位。

2.4 量子產(chǎn)率(QY)測(cè)定

使用硫酸奎寧(在350 nm的0.1 mol/L H2SO4中 QY=54%)為參比物質(zhì)，分別測(cè)試N-CQDs和硫酸奎寧的紫外-可見吸收光譜及熒光光譜，代入公式(1)：

(1)

其中η為量子產(chǎn)率，I表示熒光發(fā)射強(qiáng)度，n表示溶劑的折射率，A表示吸光度。下標(biāo)R和S分別表示已知的熒光標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)驗(yàn)樣品[10]。

2.5 N-CQDs穩(wěn)定性測(cè)定

將制備得到的N-CQDs溶液每隔7 d記錄熒光發(fā)射光譜，考察N-CQDs儲(chǔ)藏時(shí)間穩(wěn)定性。將N-CQDs溶液置于365 nm紫外光下，分別照射0，30，60，90，120，150，180 min，考察N-CQDs光漂白穩(wěn)定性。用0.5 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)N-CQDs溶液的pH值，考察N-CQDs的pH穩(wěn)定性。在N-CQDs溶液中加入50 μL NaCl溶液，其濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1 mol/L，考察N-CQDs的離子穩(wěn)定性。上述所有測(cè)試均是在417 nm激發(fā)波長(zhǎng)下記錄熒光發(fā)射光譜，平行測(cè)定3次。

2.6 N-CQDs檢測(cè)Co2+

在熒光比色皿中，加入1 mL 100倍分散體 N-CQDs 溶液、1 mL PBS(pH=7)以及分別加入濃度為 0.1，0.5，1，2，5，8，10，12，15， 20，25，30，40，50，60，70，80，90，100 μg/mL 的Co2+溶液，混合均勻后20 ℃反應(yīng)10 min。417 nm激發(fā)波長(zhǎng)下記錄熒光發(fā)射光譜，以熒光猝滅率F/F0為指標(biāo)(F是加入Co2+溶液時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0是不加入Co2+溶液時(shí)的熒光強(qiáng)度)。

在N-CQDs溶液中，分別加入1 mL濃度為100 μg/mL的金屬離子水溶液(Co2+、K+、Zn2+、Ba2+、Mg2+、Na+、Cd2+、Ca2+、Ni2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+、Al3+、Mn2+、Cr3+)，檢測(cè)存在不同代表性離子的熒光強(qiáng)度，考察其選擇性。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

分別以來自實(shí)驗(yàn)室的自來水和青衣江(中國(guó)雅安)的河水作為實(shí)際檢測(cè)樣品，評(píng)估N-CQDs檢測(cè)Co2+的實(shí)際適用性。根據(jù)HJ/T 91-2002采集樣品后，將兩種樣品都分為兩份。一份經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用硫酸溶液調(diào)節(jié)水樣pH小于2，用于分光光度法檢測(cè)(HJ 550-2015)；另一份經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，用硫酸溶液調(diào)節(jié)水樣pH至中性，用于N-CQDs檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 N-CQDs制備條件優(yōu)化

為了獲得高熒光性能的N-CQDs，考察了水熱反應(yīng)溫度、水熱反應(yīng)時(shí)間、骨粉量和乙二胺量對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響。由圖2(a)可知，水熱反應(yīng)溫度為200 ℃時(shí)(6 g骨粉，0.8 mL乙二胺，12 h)，N-CQDs熒光強(qiáng)度最高。當(dāng)水熱反應(yīng)溫度開始升高，N-CQDs熒光強(qiáng)度也隨之增加，可能是由于在碳化過程中合成了更多的N-CQDs顆粒；但隨著溫度進(jìn)一步升高，N-CQDs熒光強(qiáng)度下降，這可能是由于N-CQDs顆粒發(fā)生了團(tuán)聚[12]。由圖2(b)可知，當(dāng)水熱反應(yīng)時(shí)間為12 h時(shí)(6 g骨粉，0.8 mL乙二胺，200 ℃)，N-CQDs熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值。由圖2(c)可知，在骨粉量為6 g時(shí)(0.8 mL乙二胺，水熱12 h，200 ℃)N-CQDs熒光最強(qiáng)。由2(d)可知，在乙二胺量為0.8 mL時(shí)(6 g

圖1 N-CQDs的制備及檢測(cè)Co2+示意圖

圖2 水熱反應(yīng)溫度(a)、水熱反應(yīng)時(shí)間(b)、骨粉量(c)、乙二胺量(d)對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響。插圖：N-CQDs在紫外暗箱中的圖片。

骨粉，0.8 mL乙二胺，12 h)，N-CQDs熒光強(qiáng)度最高，隨著乙二胺用量繼續(xù)增加，N-CQDs熒光強(qiáng)度降低，可能是由于表面氨基數(shù)量增加，更易導(dǎo)致碳量子點(diǎn)聚合，產(chǎn)生自猝滅[13]。

3.2 N-CQDs表征

圖3 N-CQDs的TEM圖(a)、粒徑分布圖(b)、XRD譜圖(c)、FT-IR譜圖(d)。插圖：N-CQDs的HRTEM圖。

圖4 (a)N-CQDs的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，插圖：N-CQDs水溶液在可見光(左)和紫外光(365 nm，右)下的照片；(b)不同激發(fā)波長(zhǎng)下N-CQDs的發(fā)射光譜。

采用XPS分析了N-CQDs表面的化學(xué)元素及

圖5 (a)N-CQDs的XPS譜圖;(b)C1s的高分辨率XPS譜圖;(c)N1s的高分辨率譜圖;(d)O1s的高分辨率XPS譜圖。

圖6 儲(chǔ)藏時(shí)間(a)、紫外照射時(shí)間(b)、pH(c)、NaCl濃度(d)對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響。

照射180 min、不同濃度NaCl條件和較寬的pH范圍內(nèi)，N-CQDs依然顯示出強(qiáng)熒光、良好的穩(wěn)定性和抗漂白性。

3.3 N-CQDs檢測(cè)Co2+

如圖7(a)所示，研究了N-CQDs對(duì)不同金屬離子的選擇性，將各種金屬離子分別添加到N-CQDs的水溶液中，包括Co2+、K+、Zn2+、Ba2+、Mg2+、Na+、Cd2+、Ca2+、Ni2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+、Al3+、Mn2+、Cr3+，金屬離子的濃度均為100 μg/mL，僅Co2+具有猝滅N-CQDs熒光強(qiáng)度的能力，而其他金屬離子幾乎沒有猝滅作用。圖7(b)顯示，在N-CQDs/Co2+溶液中加入其他干擾物質(zhì)后，溶液的熒光強(qiáng)度無明顯變化，表明這些干擾物質(zhì)對(duì)Co2+的測(cè)定基本無干擾，這可能是由于Co2+與N-CQDs表面的某些官能團(tuán)(—COOH、—OH、—CONH)反應(yīng)形成復(fù)合物，促使電子從N-CQDs的激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)移到Co2+的3d軌道，導(dǎo)致熒光猝滅[38]。如圖7(c)、(d)所示，隨著Co2+濃度的

圖7 (a)不同金屬離子對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響;(b)其他物質(zhì)存在時(shí)Co2+的測(cè)定;(c)不同Co2+濃度對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響；(d)F/F0與Co2+濃度在0～100 μg·mL-1的關(guān)系曲線(F是加入Co2+溶液時(shí)N-CQDs的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0是不加入Co2+溶液時(shí)N-CQDs的熒光強(qiáng)度)，插圖：F/F0與Co2+濃度的線性關(guān)系(紅色曲線：0～15 μg·mL-1；藍(lán)色曲線：30～80 μg·mL-1)；(e)在不同溫度下Co2+猝滅的N-CQDs的Stern-Volmer曲線；(f)不存在和存在 Co2+ 時(shí)N-CQDs的紫外-可見吸收光譜。

增加，N-CQDs在488 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低。Co2+濃度為0～15 μg/mL(Y=-0.01104X+0.98879，R2=0.980 21)和30～80 μg/mL(Y=-0.0034X+0.85301，R2=0.990 06)時(shí)與N-CQDs猝滅程度呈線性關(guān)系，檢出限(S/N=3)達(dá)到20 μg/L，低于WHO規(guī)定的限量值。與表1中Co2+檢測(cè)方法相比較，本方法具有檢出限較低、線性范圍寬、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

表1 Co2+檢測(cè)方法比較

熒光猝滅是熒光分子的表面基團(tuán)與猝滅物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，通常分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅的熒光猝滅常數(shù)隨溫度升高而減小，動(dòng)態(tài)猝滅的熒光猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大[29]。為了研究Co2+對(duì)N-CQDs熒光猝滅的機(jī)理，本文考察了不同溫度下Co2+對(duì)N-CQDs的猝滅作用，并用Stern-Volmer方程來判斷猝滅機(jī)理。Stern-Volmer方程為：

F0/F=1+KSVC(Co2+)，

(2)

其中F0是不加入Co2+溶液時(shí)N-CQDs的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)是加入Co2+溶液時(shí)N-CQDs的熒光強(qiáng)度，KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù)，C為加入Co2+的濃度，曲線如圖7(e)所示。在15，25，35 ℃下，猝滅常數(shù)KSV分別為0.013 1，0.011 9，0.009，即隨著溫度升高，猝滅常數(shù)KSV減小，表明Co2+是通過靜態(tài)猝滅使得N-CQDs的熒光發(fā)生猝滅。此外，圖7(f)顯示，在N-CQDs溶液中加入Co2+后，其紫外吸收峰發(fā)生了變化，這可能是Co2+與N-CQDs的表面官能團(tuán)形成了非熒光的基態(tài)復(fù)合物，并沒有在N-CQDs的激發(fā)態(tài)發(fā)生反應(yīng)。以上結(jié)果充分證明Co2+對(duì)N-CQDs的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

3.4 實(shí)際樣品中Co2+的檢測(cè)

選擇自來水和河水為實(shí)際樣品，然后采用加標(biāo)回收法檢測(cè)水樣中的Co2+，結(jié)果如表2所示。該方法的回收率為97.26%～109.14%，RSD<3.24%，回收率的準(zhǔn)確度優(yōu)于分光光度法分析結(jié)果96.15%～117.05%，表明N-CQDs能夠用于實(shí)際水樣中Co2+的檢測(cè)。

表2 自來水和河水中Co2+的檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié) 論

本文以生物質(zhì)廢棄物豬骨為碳源，通過一步水熱法合成了N-CQDs。XPS和FT-IR表征分析表明氮元素成功摻雜到碳量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)中。N-CQDs的平均粒徑為2.34 nm，顆粒分散均勻，表現(xiàn)出良好的溶解度、高穩(wěn)定性和高熒光強(qiáng)度?；贑o2+能夠有效猝滅N-CQDs的熒光，建立了一種高靈敏性和選擇性的Co2+的檢測(cè)方法，檢測(cè)線性范圍為0～15 μg/mL和30～80 μg/mL，檢出限為20 μg/L，并能夠用于實(shí)際樣品中Co2+的檢測(cè)，為環(huán)境分析提供了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)Co2+的新方法。

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