新型姜黃素衍生物熒光探針的合成及對半胱氨酸的選擇性識別

羅 凡， 鄭東濱， 陽志強(qiáng)， 鄧 赟

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 611137)

1 引 言

半胱氨酸(Cysteine，Cys)是一種生物體內(nèi)常見的脂肪族含巰基的小分子氨基酸，它主要來源于甲硫氨酸的脫甲基以及胱氨酸的還原[1]。半胱氨酸具有的獨(dú)特的親核性以及氧化還原特性，使得它在各種生理過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，例如細(xì)胞代謝、氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)的合成等[2-5]。Cys在生理濃度范圍時(20～300 μmol·L-1)，能起到保護(hù)細(xì)胞抗氧化防御、調(diào)節(jié)新陳代謝等作用[6]。一旦濃度異常，可能會引發(fā)一系列的疾病，例如生長不良、肝損傷、神經(jīng)毒性、造血功能減退、炎癥性腸病、慢性阻塞性肺疾病等[7-11]。因此，建立一種快速定量檢測Cys的方法至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的半胱氨酸檢測技術(shù)主要有高效液相色譜法、碘量法、電化學(xué)分析法、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等，但大多缺點(diǎn)顯著，如樣品前處理復(fù)雜、測試結(jié)果不穩(wěn)定、步驟漫長、易被干擾、重現(xiàn)性不理想等[12-16]。與之相比，熒光分析法具有操作簡便、成本低廉、靈敏度高、不易損害細(xì)胞等優(yōu)勢[17-20]。熒光探針一般包括識別基團(tuán)、信號發(fā)射基團(tuán)和連接基團(tuán)，目前，基于Cys的化學(xué)性質(zhì)，已有許多反應(yīng)型熒光探針被報道，反應(yīng)機(jī)理包括邁克爾加成反應(yīng)、醛環(huán)化反應(yīng)、重排反應(yīng)等[21-26]。

姜黃素(Curcumin，1,7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)是一種從姜黃根中提取出的β-二酮化合物，已有研究證明，姜黃素在抗肝癌、抗腫瘤、抗炎解毒等方面發(fā)揮了出色的作用[27-28]。同時，姜黃素是一個典型的對稱性電子共軛體系，這一優(yōu)勢使其具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)。利用這一特點(diǎn)，研究者們設(shè)計了很多新穎的姜黃素衍生物，但大多被用于識別金屬離子，對生物巰基化合物的檢測報道較少[29]。在前期研究中，我們制備了三異丙基硅修飾的姜黃素類熒光探針，其能在眾多陰離子中高選擇性、高靈敏性識別檢測氟離子，這是首例基于姜黃素骨架的陰離子反應(yīng)型熒光探針[30]?；谇捌诘难芯炕A(chǔ)，本研究設(shè)計合成了一種以姜黃素-二氟化硼為基本骨架、2-氯-5-硝基苯甲酰基作結(jié)構(gòu)修飾的Cys猝滅型探針，利用Cys與探針發(fā)生取代縮合反應(yīng)和加成反應(yīng)，破壞分子共軛結(jié)構(gòu)使熒光猝滅，從而達(dá)到檢測的目的。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

測試儀器：Brucker 600核磁共振儀(內(nèi)標(biāo)物為TMS，德國布魯克公司)，ISQ EC單四極桿質(zhì)譜儀(Thermofisher公司，美國)，普析TU-1901型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，F(xiàn)97Pro18033型熒光分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)，PHS-3CPH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。除2-氯-5-硝基苯甲酰氯購自上海麥克林生化科技有限公司，其余試劑均購自成都科隆化學(xué)品有限公司。

2.2 探針的合成

2.2.1 化合物2的合成

根據(jù)文獻(xiàn)合成了化合物2[30]，將姜黃素(300 mg,0.81 mmol)和三氟化硼乙醚(345 mg,2.43 mmol)置于含30 mL無水二氯甲烷溶液的圓底燒瓶中回流攪拌過夜，產(chǎn)物經(jīng)水洗滌三次用無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑后經(jīng)硅膠柱進(jìn)一步純化。以二氯甲烷∶石油醚=2∶1(體積比)作洗脫劑，得到黃色化合物2(146 mg，43%)。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ10.09(s,2H),7.92(d,J=15.5 Hz,2H),7.47(d,J=2.0 Hz,2H),7.34(dd,J=8.3,2.0 Hz,2H),7.02(d,J=15.6 Hz,2H),6.87(d,J=8.2 Hz,2H),6.44(s,1H),3.85(s,6H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ178.73,151.35,148.18,146.98,126.00,125.28,117.87,115.96,112.40,101.11,55.77。

2.2.2 探針1的合成

將2-氯-5-硝基苯甲酰氯(66 mg,0.3 mmol)、4-二甲氨基吡啶(37 mg,0.3 mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(173 mg,0.9 mmol)置于含20 mL無水二氯甲烷溶液的圓底燒瓶中室溫攪拌10 min后，加入化合物2(120 mg，0.3 mmol)繼續(xù)攪拌8 h，產(chǎn)物經(jīng)水洗滌三次干燥有機(jī)相并過濾，以二氯甲烷作為洗脫劑經(jīng)硅膠柱純化得到橙色粉末化合物1(141 mg，60%)。m.p. 159～161 ℃。1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ8.82(d,J=2.8 Hz,2H),8.50(dd,J=8.8,2.8 Hz,2H),8.12(d,J=15.8 Hz,2H),8.00(d,J=8.9 Hz,2H),7.78(d,J=1.9 Hz,2H),7.61(dd,J=8.3,1.9 Hz,2H),7.52(d,J=8.2 Hz,2H),7.36(d,J=15.7 Hz,2H),6.69(s,1H),3.91(s,6H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ180.62,161.32,151.58,146.74,146.71,141.98,139.97,134.26,133.47,129.63,128.96,127.01,124.08,123.37,122.60,114.07,102.84,56.83。ESI-HRMS(m/z) calcd for C35H23BCl2F2-N2O12[M+Na]+805.058 7，found[M+Na]+805.059 7。

探針1的合成過程如圖1所示。

圖1 探針1的合成路線

2.3 光譜測試

配制3 mmol·L-1探針的DMSO溶液作為母液，用去離子水配制300 mmol·L-1的K+、Ca2+、Fe3+、Gly、Leu、Thr、Glu、Ser、Val、Gln、Met，以及15 mmol·L-1的Cys、Hcy、GSH。所有的光學(xué)測試均在HEPES緩沖溶液(10 mmol·L-1，含75%DMSO，pH=7.4)中進(jìn)行。激發(fā)波長為470 nm，熒光測試的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為10 nm，測試時間為30 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針對Cys響應(yīng)的光譜研究

3.1.1 探針與Cys反應(yīng)的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜

在HEPES緩沖溶液(10 mmol·L-1，含75%DMSO)的中測試了探針1(10 μmol·L-1)對Cys(100 μmol·L-1)的紫外吸收和熒光發(fā)射光譜。如圖2(a)所示，探針1在443 nm和468 nm處有最大吸收，加入10當(dāng)量的Cys后，在443 nm和468 nm的最大吸收峰減小并伴隨著387 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰，且探針溶液顏色由黃色變成無色。如圖2(b)所示，探針1的最大發(fā)射波長為526 nm，加入10當(dāng)量Cys后，在526 nm處的熒光幾乎完全被猝滅，猝滅率為95%，熒光顏色由黃色變?yōu)闊o色。

圖2 探針1(10 μmol·L-1)與Cys(100 μmol·L-1)作用的紫外吸收光譜(a)與熒光發(fā)射光譜(b)

3.1.2 探針對Cys響應(yīng)時間的研究

響應(yīng)時間是衡量一個反應(yīng)型探針重要的參數(shù)之一，所以測試了探針(10 μmol·L-1)與Cys(100 μmol·L-1)隨時間變化的熒光光譜。如圖3所示，在加入10當(dāng)量的Cys后，526 nm處的熒光強(qiáng)度在30 min基本完全猝滅，表明探針1可以穩(wěn)定且快速地檢測Cys。

圖3 探針1(10 μmol·L-1)在10當(dāng)量Cys存在下不同時間的熒光強(qiáng)度(526 nm)變化

3.1.3 熒光滴定

為了進(jìn)一步研究Cys濃度對熒光光譜的影響，進(jìn)行了熒光滴定實(shí)驗(yàn)。向10 μmol·L-1的探針溶液中依次加入不同濃度的Cys，結(jié)果如圖4(a)所示。在僅有探針的溶液中，熒光強(qiáng)度在526 nm處達(dá)到最高值，隨著Cys濃度的增大，熒光強(qiáng)度逐漸降低;當(dāng)Cys濃度增大到10當(dāng)量時，526 nm處的熒光完全猝滅。如圖4(b)所示，在10～70 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，Cys的濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=-0.0146x+1.1055(R2=0.997 5)，檢出限為2.9 μmol·L-1。上述結(jié)果證明探針對Cys響應(yīng)的靈敏度較高。

圖4 (a)探針1(10 μmol·L-1)與不同濃度的Cys(0，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，80，90，100 μmol·L-1)熒光滴定曲線，插圖為加入不同當(dāng)量Cys的探針溶液在526 nm處的熒光強(qiáng)度；(b)Cys的濃度與526 nm處熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系。

3.2 探針的選擇性研究

為了測試探針對Cys的選擇性，向探針1(10 μmol·L-1)中加入1 mmol·L-1不同分析物(K+、Ca2+、Fe3+、Gly、Leu、Thr、Glu、Ser、Val、Gln、Met)，以及100 μmol·L-1的Cys、Hcy、GSH，測定其紫外吸收光譜。如圖5(a)所示，加入Cys后，探針在443 nm和468 nm處的最大紫外吸收明顯下降，其他干擾物對探針的紫外吸收無明顯影響，只有Hcy和GSH顯示出輕微的干擾。為了進(jìn)一步評估探針檢測Cys的抗干擾能力，在不同分析物的探針溶液中加入100 μmol·L-1的Cys，測定其熒光發(fā)射光譜。如圖5(b)所示，結(jié)果顯示的變化與紫外吸收一致，Cys可以使探針在526 nm處的熒光完全猝滅，即使在過量的其他干擾物的存在下也不會發(fā)生變化。Hcy和GSH的熒光強(qiáng)度雖略有降低，但與Cys相比降低程度不明顯，猝滅率分別為21%和30%。這表明探針對Cys的響應(yīng)具有較高的選擇性。

圖5 (a)探針1(10 μmol·L-1)與不同分析物作用的紫外吸收光譜；(b)在不同分析物的存在下，探針1(10 μmol·L-1)與10當(dāng)量的Cys作用的熒光強(qiáng)度(526 nm)變化(1.Cys, 2.Fe3+, 3.Ca2+, 4.K+, 5.Gly, 6.Leu, 7.Thr, 8.Glu, 9.Ser, 10.Val, 11.Gln, 12.Met, 13.Hcy, 14.GSH)。

3.3 探針對Cys檢測pH范圍的研究

為了研究探針在生理?xiàng)l件下對Cys是否有良好的檢測性能，研究了pH對純探針(10 μmol·L-1)以及加入100 μmol·L-1Cys后的探針的熒光強(qiáng)度的影響。如圖6所示，在pH值5.0～8.0范圍內(nèi)，純探針溶液的熒光強(qiáng)度基本保持不變; 加入100 μmol·L-1的Cys后，在pH值6.5～8.0范圍內(nèi)，探針溶液的熒光強(qiáng)度發(fā)生了顯著的變化。在pH值為7.4時，加入的Cys能使探針的熒光基本完全猝滅。上述研究表明探針能在生理?xiàng)l件下實(shí)現(xiàn)對Cys的較好選擇性識別。

圖6 探針1(10 μmol·L-1)與加入Cys(100 μmol·L-1)的探針溶液在pH=5～8的影響下526 nm處熒光強(qiáng)度的變化

3.4 探針對Cys的識別機(jī)理研究

為了研究探針對半胱氨酸識別機(jī)理，對加入10當(dāng)量的半胱氨酸的探針溶液進(jìn)行高分辨質(zhì)譜檢測，如圖7所示，在m/z=207.050 84處的峰可以合理地歸屬于[2-2H+]2-(理論值為207.054 3)。推測探針與Cys發(fā)生如圖8所示的反應(yīng)，可能存在兩種反應(yīng)途徑:一是探針分子加入Cys后，巰基與苯環(huán)上的氯原子發(fā)生親核取代反應(yīng)(圖8中Route 1)，氨基進(jìn)攻羰基碳發(fā)生分子內(nèi)縮合生成苯并七元環(huán)3(在m/z=267.008 24處的峰可以歸屬于化合物3，理論值為267.007 6)；二是化合物2骨架雙鍵與Cys發(fā)生加成反應(yīng)(圖8中Route 2)，導(dǎo)致共軛結(jié)構(gòu)被破壞，熒光猝滅(在m/z=560.132 0處的峰可以歸屬于化合物[4+Na]+，理論值為

圖7 探針1與10當(dāng)量Cys反應(yīng)質(zhì)譜圖

圖8 探針1對Cys的可能識別機(jī)理

560.133 8)。這兩種途徑也可能同時進(jìn)行。

3.5 水樣檢測

為了研究探針1在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用，對成都中醫(yī)藥大學(xué)的自來水、河水中不同濃度的半胱氨酸進(jìn)行了檢測。直接過濾水樣，調(diào)節(jié)pH至7.4，向含探針的水樣中添加不同濃度的半胱氨酸(20，40，60 μmol·L-1)。如表1所示，計算了自來水和河水中半胱氨酸的回收率，回收率范圍為98%～109%。結(jié)果表明，探針1在實(shí)際水樣半胱氨酸的定量檢測中有潛在的應(yīng)用價值。

表1 水樣中Cys的檢測結(jié)果

4 結(jié) 論

本文合成了一種以姜黃素-二氟化硼作為基本骨架的新型猝滅型探針。該探針在生理?xiàng)l件下對Cys表現(xiàn)出高靈敏度、高選擇性以及快速響應(yīng)，其檢測限為2.9 μmol·L-1。識別機(jī)理推測為Cys與姜黃素中2-氯-5硝基甲?；鶊F(tuán)發(fā)生親核取代關(guān)環(huán)反應(yīng)和Cys與姜黃素骨架雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)，使分子的共軛結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致探針熒光猝滅。響應(yīng)時間為30 min，溶液顏色由黃色變?yōu)闊o色。此外，該探針能成功應(yīng)用于水樣模擬檢測。本研究為構(gòu)建新的天然姜黃素衍生物熒光探針提供了思路。

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