固本化瘀法對(duì)2型糖尿病大鼠足細(xì)胞損傷及信號(hào)通路的影響

陸 軍，李 紅

(1.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，太原 030013；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病二科，太原 030013)

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是終末期腎臟病常見的病因之一[1]，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且缺乏有效的防治手段。足細(xì)胞損傷是貫穿糖尿病腎病的病理環(huán)節(jié)，高糖及糖基化終末產(chǎn)物刺激、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活等可造成腎病蛋白(nephrin)、足細(xì)胞蛋白(podocin)和CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)等足細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而造成足細(xì)胞損傷、腎小球?yàn)V過膜通透性增加并產(chǎn)生蛋白尿[2-4]。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎病屬于“消渴”、“尿濁”、“虛勞”范疇，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛指脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)指痰濕血瘀，根據(jù)病機(jī)主張給予固本化瘀方進(jìn)行治療。相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，固本化瘀法含藥血清對(duì)高糖引起的足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[5]；另有多囊卵巢綜合征及胰島素抵抗相關(guān)的研究證實(shí)，固本化瘀法能夠促進(jìn)大鼠體內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)通路激活[6]?；诖耍狙芯繉⒁?型糖尿病大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察固本化瘀法對(duì)大鼠足細(xì)胞損傷及PI3K/Akt通路的影響，旨在探究固本化瘀法在糖尿病腎病防治中的作用及機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 全自動(dòng)生化分析儀(GE公司)；正置顯微鏡(Nikon公司)；熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)。

1.2試藥 HE染色試劑盒(上海碧云天公司);RNA提取、cDNA第一鏈合成、熒光定量PCR試劑盒，均購自北京天根生化公司;p-PI3K和p-Akt一抗，均購自Abcam公司。固本化瘀方的藥材包括鹿角膠、龜甲膠、枸杞、黨參、淫羊 董、巴戟天、川斷、當(dāng)歸、丹參、莪術(shù)、三棱、蒼術(shù)、香附、膽 南星、茯苓、陳皮和半夏，由本院藥劑科采購，按每毫升生藥含量25、15、5 g制備濃煎藥汁，待使用時(shí)進(jìn)行稀釋。

1.3動(dòng)物 成年雄性SD大鼠，湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量為180～200 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SCXK(湘) 2019-0003。

2 方法

2.1分組、造模及給藥 將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及固本化瘀方低、中和高劑量組，每組各10只。對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)，其余各組用高脂高糖飼料喂養(yǎng)；6周后禁食不禁水過夜，對(duì)照組一次性腹腔注射等體積溶媒，其余各組以65 mg·kg-1一次性腹腔注射10 g·L-1鏈脲佐菌素，1周后經(jīng)尾靜脈檢測空腹血糖(FBG)≥11.1 nmol·L-1認(rèn)為造模成功。造模成功后，固本化瘀方低、中、高劑量組分別給予含有22.1、44.2、88.4 g·kg-1生藥的固本化瘀方藥液灌胃，對(duì)照組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃，灌胃劑量為0.01 mL·g-1，每日1次，連續(xù)4周。

2.2生化指標(biāo)檢測 末次給藥后將大鼠放入代謝籠、收集24 h尿液，采用生化分析儀檢測尿微量白蛋白(mAlb)及尿肌酐(Ucr)，計(jì)算尿mAlb/Ucr；斷頭處死大鼠，立即收集血液樣本5～6 mL，離心分離血清后采用生化分析儀檢測FBG、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)。

2.3腎臟病理改變檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量，用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定后制作4 μm病理切片，采用HE染色試劑盒進(jìn)行染色后在顯微鏡下觀察腎臟病理改變。

2.4足細(xì)胞標(biāo)志分子mRNA表達(dá)檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量，采用RNA提取試劑盒分離提取組織中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)、合成cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，對(duì)目的基因nephrin、podocin、CD2AP及內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、預(yù)混液 10 μL、10 μmol·L-1上游引物及下游引物各0.4 μL、去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。完成PCR反應(yīng)后生成反應(yīng)的循環(huán)曲線、得到循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算nephrin、podocin、CD2AP的mRNA表達(dá)水平。

2.5p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)檢測 處死大鼠后解剖腎臟組織適量，采用組織裂解液進(jìn)行勻漿，提取組織蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，取30 μg蛋白樣本進(jìn)行電泳以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶在室溫封閉PVDF膜1 h，用1∶1 000稀釋的p-PI3K、p-Akt一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗在4 ℃孵育PVDF膜過夜，次日用1∶2 000稀釋的二抗在室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到p-PI3K、p-Akt及β-actin的條帶及吸光值，以β-actin的吸光值為內(nèi)參、計(jì)算p-PI3K及p-Akt的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠FBG、Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均顯著升高(P<0.05)；固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠FBG與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Scr、BUN和尿mAlb/Ucr均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

3.2各組大鼠腎臟病理改變比較 對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球形態(tài)正常；模型組大鼠腎臟內(nèi)腎小球萎縮，洗膜及基底膜增厚，少量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，低、中和高劑量組大鼠腎臟的病理改變明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理改變的比較 (HE染色)

3.3各組大鼠腎臟中足細(xì)胞標(biāo)志分子mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腎臟中nephrin、podocin和CD2AP的比較

3.4各組大鼠腎臟中PI3K/Akt通路比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，固本化瘀方低、中和高劑量組大鼠腎臟組織中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，結(jié)果見圖2和表3。

圖2 各組大鼠腎臟中p-PI3K、p-Akt的電泳圖

表3 各組大鼠腎臟中 p-PI3K、p-Akt的比較

4 討論

足細(xì)胞是位于腎小球基底膜外側(cè)的一種高度分化的終末細(xì)胞，參與腎小球?yàn)V過膜的構(gòu)成，足細(xì)胞損傷貫穿糖尿病腎病的病程始終，減輕足細(xì)胞損傷也成為近年來防治糖尿病腎病的重要靶點(diǎn)[7-8]。足細(xì)胞中nephrin、podocin和CD2AP等分子參與構(gòu)成足細(xì)胞裂隙膜，上述分子表達(dá)降低被視作足細(xì)胞損傷的標(biāo)志[9-12]。本研究采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)及鏈脲佐菌素腹腔注射的方式建立2型糖尿病模型，造模后檢測到Scr、BUN和尿mAlb/Ucr水平升高，腎臟出現(xiàn)了典型的糖尿病腎病病理改變且nephrin、podocin和CD2AP的表達(dá)降低，表明2型糖尿病大鼠出現(xiàn)了腎功能損害及足細(xì)胞損傷。

根據(jù)中醫(yī)理論，糖尿病腎病的發(fā)病與陰陽兩虛、氣滯血瘀有關(guān)，固本化瘀法能夠通過益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、健脾固腎等發(fā)揮治療糖尿病腎病的作用[13-14]。本研究在2型糖尿病大鼠造模后給予不同劑量固本化瘀方治療，治療后Scr、BUN、尿mAlb/Ucr水平均明顯降低且腎臟病理改變明顯減輕，表明固本化瘀方能夠減輕2型糖尿病大鼠的腎臟損害。固本化瘀方相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方的含藥血清能夠減輕高糖引起的足細(xì)胞損傷，本研究觀察固本化瘀方減輕2型糖尿病模型大鼠足細(xì)胞損傷的作用，結(jié)果顯示,不同劑量固本化瘀方干預(yù)后，腎臟組織中nephrin、podocin和CD2AP的表達(dá)增加，與既往文獻(xiàn)在離體細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]吻合，表明固本化瘀方能減輕2型糖尿病大鼠的足細(xì)胞損傷。

足細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且與PI3K/Akt通路和TGF-β/Smad通路的異常激活或抑制密切相關(guān)[15-17]。PI3K/Akt通路以磷酸化的形式發(fā)生激活，激活后具有促進(jìn)細(xì)胞存活及增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病大鼠的腎臟組織中以及高糖處理的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞及足細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平降低[18-20]。本研究觀察到2型糖尿病大鼠腎臟中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平降低，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。固本化瘀方具有激活PI3K/Akt通路的作用，本研究在使用不同劑量固本化瘀方干預(yù)后觀察到腎臟組織中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平增加，表明固本化瘀方能夠促進(jìn)2型糖尿病大鼠腎臟組織中PI3K/Akt通路的激活，這也可能是固本化瘀方減輕腎臟病理改變及足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。

綜上所述，2型糖尿病大鼠存在足細(xì)胞損傷的情況，由于激活PI3K/Akt通路是固本化瘀法減輕足細(xì)胞損傷的可能分子機(jī)制，固本化瘀方干預(yù)能夠減輕2型糖尿病大鼠足細(xì)胞損傷，本研究為今后防治糖尿病腎病、減輕足細(xì)胞損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。