金毛狗脊指紋圖譜前處理方法探索

陸燕萍，徐佳蘭，彭小晶，何 嫣，鞏曉宇*，趙 敏

(1.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518172；2.湖南網(wǎng)絡工程職業(yè)學院，湖南 長沙 410018)

狗脊(Cibotii Rhizoma)為蚌殼蕨科植物金毛狗脊(Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.)干燥根莖。作為國家二級保護植物金毛狗脊[1]生長于山腳陰濕緩坡或溝谷密林下陰濕的酸性土壤，主要分布于熱帶至亞熱帶地區(qū)。其資源分布廣，福建、廣西、貴州、云南、廣東、江西、湖南、四川、重慶、浙江等地均有出產(chǎn)，其中以福建、廣西、貴州、云南為多[2]。狗脊為《中國藥典》收載的常用中藥，功效為祛風濕、補肝腎、強腰膝等，臨床用于治療風濕痹痛、腰膝酸軟、下肢無力[3]。其主要化學成分為水溶性酚酸類(以原兒茶酸為代表)、蕨素類、黃酮類、揮發(fā)油等活性成分[4]，現(xiàn)代藥理研究表明，具有抗骨質(zhì)疏松、抑制血小板聚集、抗炎、抗風濕、保肝、抗氧化及抗癌等藥理活性[5-10]?！吨袊幍洹?2020年版)[3]以原兒茶酸為指標進行含量測定作為主要的質(zhì)量控制方法，并不能完全反映狗脊多組分特征。本項目通過建立可反映中藥狗脊多組分特征的HPLC色譜指紋圖譜，用于狗脊種源鑒別、種植、加工、炮制、生產(chǎn)、檢驗和研究全過程的質(zhì)量控制，為有效控制中藥狗脊質(zhì)量、提高狗脊質(zhì)量標準提供依據(jù)。本文通過建立狗脊水溶性酚酸類多成分同時檢測的基礎上，運用正交實驗設計及方差分析優(yōu)化狗脊HPLC色譜指紋圖譜樣品前處理方法，為后期建立合理的狗脊HPLC色譜指紋圖譜提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

儀器與試藥：Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent OpenLAB 色譜工作站帶四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器)，F(xiàn)A2004型萬分之一電子分析天平(上海天平儀器廠)，VGT-01型超聲波清洗器(深圳市威固特超聲波科技開發(fā)有限公司)，XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)，甲醇、乙腈為色譜純(德國MERCK公司)；Milli Q 純化水系統(tǒng)制備實驗用水，其他試劑均為分析純。

5-羥甲基糖醛(11626-202013，5-HMF)、原兒茶酸(110809-201906)、原兒茶醛(110810-201909)對照品均購置于中國食品藥品檢定研究院，純度經(jīng)HPLC檢測大于99.9%。狗脊藥材(產(chǎn)地廣西玉林)，購于深圳一致醫(yī)藥公司，經(jīng)深圳市龍崗醫(yī)院陸燕萍主任藥師鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊的干燥根莖；樣本存放于深圳市龍崗醫(yī)院存樣標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)連接ZobaxC18(2.5 mm×4.6 mm，5μm)保護柱；以甲醇為流動相A，0.1%冰醋酸水溶液為流動相B，按梯度0.0～38.0 min，流動相A(%)5；38.0～48.0 min，流動相A(%)5～100洗脫；流速1.0 mL/min；進樣量10μL；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm。此色譜條件，各成分均達到基線分離，理論塔板數(shù)均大于2 000，典型色譜圖具體見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛適量，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶液配制成濃度分別為630.0、450.0及760.0μg/mL的混合對照品儲備液(母液)于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。上述儲備液精密吸? mL于100 mL容量瓶中，加入甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶液稀釋至刻度，邊加邊搖勻，即得含上述成分分別為31.50、22.50及38.00μg/mL的混合對照品工作溶液，待用。

2.1.3 供試品溶液的制備 狗脊藥材粉碎后過三號篩，取粉末約0.4 g，精密稱定，置10mL容量瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)至達到刻度線，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液即得。

2.1.4 標準曲線、線性范圍及定量限(LOQ)/檢測限(LOD) 上述混合對照品母液分別稀釋5、10、20、50、100、200倍，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，分別記錄其峰面積。橫坐標為各成分的進樣量對應峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算。取上述對照品工作溶液，依法測定其色譜峰信噪比(S/N)，以S/N為10和3相應的濃度分別作為其LOQ與LOD。各成分線性范圍及LOQ/LOD具體見表1。從所得結(jié)果看，在相應濃度范圍內(nèi)各成分線性關(guān)系良好，靈敏度表現(xiàn)良好。

表1 線性范圍及定量限(LOQ)/檢測限(LOD)結(jié)果

2.1.4 精密度試驗 精密吸取上述混合對照品工作溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別記錄峰面積。5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛對照品峰面積相對標準偏差(RSD)值分別為1.53%、1.66%、1.22%，表明該方法精密度良好。

2.1.5 回收率實驗 按“2.1.3”項下方法，稱取同一批次狗脊細粉6份，每份1 g，加入等量各對照品溶液，平行制備樣品，并按“2.1.1”項下色譜條件進行測定；回收率按公式(%)=(C-A)/B×100%(A：供試品所含被測成分量；B：加入對照品量；C：實測值)。5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛回收率分別為99.18%、100.17%、95.12%；RSD值分別為2.45%、1.89%、2.41%，表明該方法準確性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 室溫下取對照品工作溶液密封儲存于進樣瓶中，分別于0、2、6、10、16、24 h 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛對照品峰面積RSD值分別為1.95%、1.84%、1.72%，表明在該溶液條件下，各成分24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 按“2.1.3”項下方法，稱取同一批次狗脊細粉6份，每份1 g，加入等量各對照品溶液，平行制備樣品，并按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果顯示樣品中5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛平均含量分別為0.305%(RSD2.73%)、0.039%(RSD3.51%)、0.021%(RSD3.24%)，表明該方法重復性良好。

2.2 處理方法研究

2.2.1 單因素實驗 其他條件不變，分別考察溶劑類型、溶劑比例、超聲時間和次數(shù)對3個成分(5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛)總得率(Tc)的影響。

(1)溶劑類型：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉5份，分別加入甲醇、甲醇-1%冰醋酸(70∶30)、乙腈、乙腈-1%冰醋酸(70∶30)、含1%冰醋酸水溶液進行超聲處理30 min。結(jié)果顯示，添加30∶% 1%冰醋酸的混合溶劑處理時，Tc值最高，其次為含1%冰醋酸水溶液，純有機溶劑最低。甲醇-1%冰醋酸與乙腈-1%冰醋酸無明顯差異。

(2)溶劑比例：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉5份，按甲醇與含1%冰醋酸水溶液比例10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、90∶10進行超聲處理30 min。結(jié)果顯示，甲醇與含1%冰醋酸水溶液比例70∶30時，Tc值最高。

(3)超聲處理時間：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉5份，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶劑超聲處理10、20、30、40、50 min。結(jié)果顯示，超聲處理時間為50 min時，Tc值最高。

(4)超聲處理次數(shù)：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉3份，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶劑超聲處理次數(shù)分別為1～3次，每次30 min 。結(jié)果顯示，處理次數(shù)越多，Tc值越高。

2.2.2 正交設計及方差分析 在方法學考察和單因素實驗的基礎上，為優(yōu)化處理方法的工藝條件，以溶劑比例、超聲處理時間及次數(shù)3個因素為考察因子，Tc值為參考指標，具體實驗按L9(34)正交實驗表，見表2。正交實驗結(jié)果及方差分析結(jié)果見表3和表4。

表2 正交實驗因素水平

表3 正交實驗結(jié)果

表4 方差分析

由表2、3可看出，前處理方法以Tc值作為考察指標，各因素對方法的影響大小依次為A>C>B，溶劑比例對方法影響最大，超聲處理次數(shù)對方法影響最小。在實驗范圍內(nèi)，最佳的條件為A3B1C2，即樣品加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)超聲處理30 min，1次。

3 討論

以“中藥色譜指紋圖譜方法”鑒別中藥的真?zhèn)?，控制其質(zhì)量是較傳統(tǒng)的方法，更能客觀地反映中藥物質(zhì)基礎的整體觀，是更為科學、有效的質(zhì)控方法。本方法已被國家正式推行[11]。狗脊化學成分為水溶性酚酸類、蕨素類、黃酮類、揮發(fā)油等多種活性成分[2-8]，狗脊中抗炎、抗氧化的主要有效成分為原兒茶酸、原兒茶醛[12-14]，現(xiàn)行《中國藥典》采用原兒茶酸作為狗脊質(zhì)量控制標準，但5-HMF也具有改善認知功能、抗氧化的活性[15]，而且從藥材含量上看，5-HMF含量要遠遠高于原兒茶酸、原兒茶醛，其色譜行為表現(xiàn)峰面積也遠遠大于原兒茶酸、原兒茶醛[1]。同時多種植物中都含有原兒茶酸，單以原兒茶酸作為質(zhì)量控制指標專屬性不強。因此，在進行狗脊的指紋圖譜研究要綜合考慮作為主要特征峰原兒茶酸、原兒茶醛及5-HMF的色譜行為。本文即在建立5-HMF、原兒茶酸及原兒茶醛的多成分定量測定的基礎上，以3個成分總含量綜合評價藥材前處理方法，本方法專屬性高，有利于狗脊指紋圖譜質(zhì)控方法的建立。

檢測波長選擇。5-HMF 的最大吸收波長為280 nm，但考慮在此波長下5-HMF靈敏度過高而影響其他2個成分的色譜行為，故選擇5-HMF吸收相對較弱的260 nm 進行測定。

流動相選擇。本實驗系統(tǒng)地篩選了甲醇、乙腈及不同濃度各種有機酸、緩沖鹽的配伍對各成分的影響，最終確定有機相為甲醇、水相為含0.1%冰醋酸水溶液時，各待測組分分離度高且色譜峰峰形最佳，且溶劑類型有藥材處理方法一致，有利于操作。