不同產(chǎn)地白芷藥材質(zhì)量評價

吳文平，索彩仙，霍文杰，梁 慧，何民友，陳向東，李國衛(wèi)

(廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

《中國藥典》2015年版一部收載白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.EtHook.F.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。夏、秋間葉黃時采挖，除去須根和泥沙，曬干或低溫干燥。白芷味辛、性溫，歸胃、大腸、肺經(jīng)，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿作用。用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛[1]?！睹t(yī)別錄》記載：“生河?xùn)|川谷下澤，二月、八月采根，曝干；今出近道，處處有，近下濕地，東間甚多?！盵2]《圖經(jīng)本草》云：“白芷生河?xùn)|川東下澤，今所在有之，吳地尤多。”[3]

目前研究發(fā)現(xiàn)白芷中化學(xué)成分包括香豆素類、揮發(fā)油類、多糖類，還有微量元素等，其中香豆素類及其衍生物是白芷的主要成分，其中包括氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、白當(dāng)歸素、珊瑚菜素、佛手柑內(nèi)酯等。針對白芷中的主要化學(xué)成分[4-6]、指紋圖譜[7-11]、揮發(fā)油[12-14]的組成等均已有文獻報道，但較少有文獻采用同一色譜條件同時進行含量測定與特征圖譜研究的報道較少，本研究采用UPLC法對白芷藥材特征圖譜及含量測定同時進行研究，特征圖譜中共確定11個共有峰，指認(rèn)7個色譜峰，并對其中6個色譜峰進行含量測定，其中包括：水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素。采用主成分分析、系統(tǒng)聚類分析以及正交偏最小二乘法-判別分析對白芷藥材特征圖譜進行全面分析[15-18]，為白芷藥材質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters H-Class型超高液相色譜儀(美國沃特世公司)；XP26型百萬分之一電子天平、ME204E型萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-QDirect 型超純水系統(tǒng)(美國默克股份有限公司)。

歐前胡素對照品(批號：110826-201616；含量：99.6%)、異歐前胡素對照品(批號：110827-201812；含量：99.6%)由中國食品藥品檢定研究院提供；水合氧化前胡素對照品(批號：ST22410110MG；含量：98%)由上海源葉生物科技有限公司提供；白當(dāng)歸素對照品(批號：wkq16031401；含量：98%)由四川省維克奇生物科技有限公司提供；佛手柑內(nèi)酯對照品(批號：17120501；含量：98%)由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；珊瑚菜素對照品(批號：CFN90495；含量：98%)由武漢天植生物技術(shù)提供；8-甲氧基補骨脂素(批號：Whar0912；含量：98%)由南京元寶峰醫(yī)藥科技有限公司提供；乙腈、36%乙酸為色譜純；其他試劑均為分析純。

白芷藥材分別采自主產(chǎn)區(qū)河北、安徽、山東、河南地區(qū)，以家種為主，經(jīng)廣東一方制藥有限公司陳向東主任藥師鑒定為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.EtHook.F.的干燥根，藥材信息見表1。

表1 白芷藥材產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent SB C18(2.1 mm×150 mm，1.8μm)，流速為0.35 mL/min；檢測波長為300 nm；柱溫35 ℃；進樣量1μL；以流動相A為乙腈，0.1%乙酸為B，梯度洗脫為0～5.5 min：15%A→28%A，5.5～7 min：28%A→40%A，7～9.5 min：40%A，9.5～15.5 min：40%A→65%A，15.5～15.51 min：65%A→15%A，15.1～18 min：15%A。

2.2 對照品溶液的配制

取水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10、5、4、50、40、20 mg/L的對照品溶液。取8-甲氧基補骨脂素對照品適量，置25 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為40 mg/L的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取白芷藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理(300 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 精密度考察 取同一供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件連續(xù)進樣6次，各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性考察 取白芷藥材S2號樣品，按“2.3”項下確定的方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件進樣測定，各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜分析與評價

2.5.1 特征峰指認(rèn)及共有峰確定 按“2.1”項下的色譜條件分別對供試品溶液和對照品溶液進行測定，通過與對照品保留時間進行比對，確定7個化學(xué)成分，分別為水合氧化前胡素(峰1)、白當(dāng)歸素(峰2)、8-甲氧基補骨脂素(峰4)、佛手苷內(nèi)酯(峰5)、歐前胡素(峰9)、珊瑚菜素(峰10)、異歐前胡素(峰11)，對照品及供試品色譜見圖1。采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.0版)，對16批白芷藥材特征圖譜進行分析，建立各自特征圖譜并生成指紋圖譜共有模式，共確定11個共有峰，見圖2。以峰9為參照峰S峰，計算各色譜峰的相對峰面積及RSD值，見表2，各特征峰相對峰面積RSD值在17.84%～94.46%范圍內(nèi)，結(jié)果表明不同產(chǎn)地白芷藥材特征圖譜存在一定差異。

表2 白芷藥材的特征圖譜相對峰面積

圖2 16批白芷藥材特征圖譜疊加圖

2.5.2 相似度評價 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.0 版)對16批白芷藥材特征圖譜進行疊加，進行相似度評價，見表3。結(jié)果顯示，不同批次白芷藥材樣品的相似度均大于0.95，表明樣品特征圖譜與對照圖譜的相似度較高，因此，該圖譜可做為白芷藥材的特征圖譜。

注：峰1：水合氧化前胡素；峰2：白當(dāng)歸素；峰4：8-甲氧基補骨脂素；峰5：佛手苷內(nèi)酯峰9：歐前胡素；峰10：珊瑚菜素；峰11：異歐前胡素。

表3 16批白芷藥材樣品特征圖譜相似度

2.5.3 系統(tǒng)聚類分析 運用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件使用Ward聚類方法結(jié)合歐式距離系數(shù)，對白芷藥材特征圖譜進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果顯示，當(dāng)歐式距離<5時，白芷藥材分為4類，見圖3，結(jié)果顯示：安徽省藥材(S3～S9)為第1類，安徽省藥材(S1、S2)與山東省藥材(S10、S11)為第二類，河南省藥材(S14～S15)為第三類，河北省藥材(S12、S13)為第四類，同一產(chǎn)地白芷藥材均可聚類，但安徽省藥材S1、S2與山東省藥材S10、S11聚為一類，可能與栽培環(huán)境、種植條件、藥材加工方式等因素有關(guān)系。

圖3 白芷藥材聚類分析樹狀圖

2.5.4 主成分分析及正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 通過SPSS 20.0 軟件對16批白芷藥材特征圖譜相對峰面積結(jié)果進行主成分分析。由表4、表5可知，前3個成分累積方差貢獻率為86.166%，基本可以反映白芷藥材樣品信息。特征圖譜主成分1貢獻率為55.518%，占比超1/2，其中峰1(水合氧化前胡素)、峰2(白當(dāng)歸素)在主成分1中貢獻率最大，峰4(8-甲氧基補骨脂素)在主成分2中貢獻率最大，峰7在主成分3中貢獻率最大，所以可認(rèn)為水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、峰4(8-甲氧基補骨脂素)、峰7是影響白芷藥材質(zhì)量的重要因素。根據(jù)各主成分得分進行綜合評價，其綜合得分F=0.555×F1+0.197×F2+0.109×F3，可對16批白芷藥材質(zhì)量進行排序，河北省藥材S12、S13綜合得分排名為第一、第二位，且綜合得分?jǐn)?shù)大于1.0，明顯高于其他省份的藥材，由此推斷河北省白芷藥材質(zhì)量較佳，結(jié)果見表6。

表6 白芷藥材綜合得分結(jié)果

為尋找白芷藥材產(chǎn)生差異性的主要標(biāo)志物，采用OPLS-DA對白芷藥材樣品進行分析，將16批樣品各特征峰的相對峰面積導(dǎo)入SIMCA14.0 軟件中，獲得相應(yīng)模型，結(jié)果見圖3。在OPLS-DA模型中，累計解釋能力R2Y、R2X分別為0.776、0.552，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.692，均大于0.5，說明所建立的模型穩(wěn)定。采用正交偏最小二乘法分析得到各特征峰的VIP值，見圖3，結(jié)果顯示，峰10(珊瑚菜素)、峰2(白當(dāng)歸素)、峰11(異歐前胡素)、峰1(水合氧化前胡素)、峰8、峰5(佛手柑內(nèi)酯)VIP值均≥1，上述6個特征峰可作為白芷藥材質(zhì)量控制的標(biāo)志物。

圖4 VIP值圖

2.6 白芷藥材含量測定

由特征圖譜主成分分析結(jié)果可知，水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、峰4(8-甲氧基補骨脂素)是影響白芷藥材質(zhì)量的重要因素；由特征圖譜OPLS-DA分析結(jié)果可知，峰10(珊瑚菜素)、峰2(白當(dāng)歸素)、峰11(異歐前胡素)、峰1(水合氧化前胡素)、峰8、峰5(佛手柑內(nèi)酯)可作為白芷藥材質(zhì)量控制的標(biāo)志物，因8-甲氧基補骨脂素穩(wěn)定性較差，故暫不納入含量測定指標(biāo)。2015年版《中國藥典》白芷項下，將歐前胡素作為白芷藥材質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合以上信息，將峰1(水合氧化前胡素)、峰2(白當(dāng)歸素)、峰5(佛手柑內(nèi)酯)、峰9(歐前胡素)、峰10(珊瑚菜素)、峰11(異歐前胡素)作為含量測定指標(biāo)，與特征圖譜采用相同色譜條件，進行測定。

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密稱取水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)脂、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素對照品2.452 mg、2.132 mg、2.258 mg、2.648 mg、2.051 mg、2.239 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作為混合對照品母液。精密吸取上述母液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得線性混合對照品系列溶液。精密吸取上述混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖，以各組分峰面積(Y)與對照品溶液(X，1μg/mL)進行回歸處理，得各組分回歸方程及線性范圍，見表7。

表7 6個化合物的回歸方程及線性范圍

2.6.2 精密度實驗 分別精密吸取同一供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。計算水合氧化前胡素峰面積RSD值為0.21%、白當(dāng)歸素峰面積RSD值為0.22%、佛手柑內(nèi)酯峰面積RSD值為0.15%、歐前胡素峰面積RSD值為0.12%、珊瑚菜素峰面積RSD值為0.21%、異歐前胡素峰面積RSD值為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、6、10、15、20、24 h進樣，記錄峰面積。計算水合氧化前胡素峰面積RSD值為0.57%、白當(dāng)歸素峰面積RSD值為0.65%、佛手柑內(nèi)酯峰面積RSD值為0.51%、歐前胡素峰面積RSD值為0.38%、珊瑚菜素峰面積RSD值為0.26%、異歐前胡素峰面積RSD值為0.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4 重復(fù)性實驗 按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按照“2.1”項下色譜條件。計算水合氧化前胡素含量RSD值為0.54%、白當(dāng)歸素含量RSD值為0.63%、佛手柑內(nèi)酯含量RSD值為0.86%、歐前胡素含量RSD值為0.79%、珊瑚菜素含量RSD值為0.71%、異歐前胡素含量RSD值為1.00%，表明本法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率實驗 取已知含量白芷藥材(批號：S2)0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按照1∶1濃度精密加入對照品混合溶液；按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果見表8。

表8 白芷藥材加樣回收率實驗結(jié)果

2.6.7 白芷藥材樣品含量測定結(jié)果及分析 16批白芷藥材的佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素的含量RSD值在15.19%～31.97%范圍內(nèi)，說明不同產(chǎn)地的樣品中4種成分的含量較為穩(wěn)定。水合氧化前胡素含量的RSD值為48.29%，白當(dāng)歸素含量的RSD值為67.43%，波動較大，說明不同產(chǎn)地的樣品上述兩種成分差異較大。16批樣品的水合氧化前胡素的含量均值為0.507 mg/g，白當(dāng)歸素的含量均值為0.295 mg/g，河北產(chǎn)地的樣品兩種含量均明顯高于均值，說明河北產(chǎn)地的白芷樣品質(zhì)量較優(yōu)；安徽產(chǎn)地的兩者含量均接近均值，質(zhì)量較為穩(wěn)定；河南產(chǎn)地的樣品含量基本低于兩者的均值，質(zhì)量較差。

3 分析與討論

3.1 色譜條件考察

本實驗建立白芷藥材特征圖譜與指標(biāo)成分含量同時測定的UPLC方法，分別對不同色譜柱、流動相、柱溫、流速、檢測波長等因素進行考察，確定最終色譜條件為采用Agilent SB C18(2.1 mm×100 mm，1.8μm)，流動相為乙腈-0.1%乙酸進行梯度洗脫，流速為0.35 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長為300 nm，分離效果最佳，分析時間短，方法重復(fù)性良好。

表9 16批白芷藥材含量測定結(jié)果

3.2 特征圖譜分析

本實驗采用UPLC法建立白芷藥材的特征圖譜并同時測定白芷藥材中6個成分含量。白芷藥材特征圖譜共確定11個共有峰，對其中7個共有峰進行化學(xué)成分指認(rèn)，通過相似度計算得到16批白芷藥材對照圖譜與各批次樣品間相關(guān)性較好，相似度可達(dá)到0.95以上，說明16批白芷藥材間特征圖譜相似度高，11個共有峰能在樣品中穩(wěn)定存在。通過對16批白芷藥材特征峰的相對峰面積進行分析，從主成分綜合得分結(jié)果可知，排名前三的藥材分別是來自河北省2批，河南省1批，排名前十的結(jié)果表明白芷藥材分別來自河北省2批，安徽省4批，河南省2批，山東省2批，綜合來說，河北省2批白芷藥材排名最高，質(zhì)量最佳；山東省白芷藥材質(zhì)量較穩(wěn)定，不同批次間差異較?。缓幽鲜?、安徽省白芷藥材整體綜合得分排名上中下都有分布，不同批次白芷藥材質(zhì)量差異較大；分析16批白芷藥材特征圖譜特征峰主成分及6個指標(biāo)成分的主成分表，發(fā)現(xiàn)兩者主成分1中均是水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素貢獻度最大，主成分1又在所有主成分中占比約1/2，說明水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素可作為白芷藥材決定性成分。根據(jù)OPLS-DA分析，篩選出影響白芷藥材質(zhì)量的標(biāo)志物。從系統(tǒng)聚類分析，發(fā)現(xiàn)河北省、河南省白芷藥材能聚在一類；安徽省與山東省白芷藥材間分類不夠明顯，可能與藥材栽培環(huán)境、種植習(xí)慣、藥材處理方式、采集時間、儲存環(huán)境等因素有關(guān)。因安徽省和山東省同屬于華東地區(qū)，所處自然環(huán)境相似，可能導(dǎo)致部分藥材質(zhì)量相似，區(qū)分不明顯，而河南屬于華中地區(qū)，河北屬于華北地區(qū)，三個地區(qū)各有各自的資源特點，環(huán)境可能是導(dǎo)致藥材質(zhì)量產(chǎn)生差異的主要原因。

3.3 含量測定分析

《中國藥典》2015年版白芷項下，規(guī)定歐前胡素含量不少于0.08%，16批樣品歐前胡素的含量均值為2.570mg/g，RSD值為21.10%，均符合藥典要求，且歐前胡素含量波動差異較??；佛手柑內(nèi)酯、珊瑚菜素、異歐前胡素的含量RSD值在15.19%～31.97%范圍內(nèi)，而水合氧化胡素、白當(dāng)歸素含量RSD值分別為48.29%、67.43%；特征圖譜的主成分分析發(fā)現(xiàn)，影響特征圖譜主成分1中水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素貢獻率最大；經(jīng)特征圖譜OPLS-DA也同時分析出水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素的VIP值大于1.0，是影響白芷藥材質(zhì)量的標(biāo)志物；王夢月等[19]對白芷藥材中總香豆素的藥理作用進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白芷藥材中總香豆素具有抗炎、鎮(zhèn)痛和解痙的功效，水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素都屬于香豆素類成分，從含量測定結(jié)果可知，水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素在16批藥材含量RSD%值較大，不同產(chǎn)地的白芷藥材質(zhì)量有一定差異，故建議將水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素作為白芷藥材含量測定指標(biāo)成分，更好的控制白芷藥材質(zhì)量。

4 結(jié)語

本實驗通過對不同產(chǎn)地白芷藥材的特征圖譜及多指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果分析，為白芷藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定、質(zhì)量控制提供一定參考。該方法用時時間短、分析效率快、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可為白芷藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一個合理的、有效的評價方法。