五加參歸芪精改善小鼠心氣虛量效關(guān)系研究

姜文月，韓淑麗，唐明哲，曲佳樂，高 陸，邢 成，李鵬東*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長春 130012；3.通藥制藥集團(tuán)股份有限公司，吉林 通化 134001)

“五加參歸芪精”是由刺五加、黃芪、當(dāng)歸3味中藥組方制備的中藥口服液，具有扶正固本、補(bǔ)氣固表、補(bǔ)血養(yǎng)血的功效，用于久病衰弱、失眠自汗、腰膝酸軟、氣短心悸[1]。本研究通過建立小鼠心氣虛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂疾煳寮訁w芪精改善心氣虛的藥效作用及量效關(guān)系，為臨床應(yīng)用推廣提供數(shù)據(jù)支撐。

本研究選擇“基礎(chǔ)進(jìn)食+負(fù)重游泳+灌服心得安”方法復(fù)制小鼠心氣虛模型，饑則損氣、勞則耗氣，力竭游泳增加小鼠耗氧量、損傷小鼠正氣，且使小鼠受到驚嚇、耗傷心氣，符合中醫(yī)心氣虛證的病因；灌服心得安，抑制交感神經(jīng)對(duì)心臟的興奮性刺激，使心肌缺血缺氧而致心肌結(jié)構(gòu)功能改變，進(jìn)一步將氣虛定位于心[2-7]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectra Max Plus 384型酶標(biāo)儀(美國美谷分子儀器有限公司)；Ultra-6100紫外-可見分光光度計(jì)(北京普源精電科技有限公司)；JY2003電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，精度1 mg)；TDZ5-WS臺(tái)式低速多管自動(dòng)平衡離心機(jī)(長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)；DK-98-ⅡA水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

五加參歸芪精(批號(hào)180519)由通藥制藥集團(tuán)股份有限公司提供；人參口服液(批號(hào)180602)由吉林天力泰藥業(yè)有限公司提供；心得安片(鹽酸普萘洛爾片，批號(hào)E190147)購自亞邦藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；小鼠白介素-2(IL-2)測(cè)試盒(批號(hào)20190615)、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)試盒(批號(hào)20190617)、總蛋白定量測(cè)定試劑盒(批號(hào)20190612)、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20190612)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20190611)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號(hào)20190612)、肌酸激酶(CK)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20190613)均購自南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射液(批號(hào)181041D01，濃度為0.9%)購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g(6～8周齡)，雌雄各半，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK(吉)-2016-0003，檢疫合格。日常飼養(yǎng)與管理：動(dòng)物飼養(yǎng)于放有墊料的PC聚碳酸酯鼠盒中，每籠6只，自由飲用蒸餾水及進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料；飼養(yǎng)間溫度20.0～25.9 ℃，日溫差0～4.9 ℃；飼養(yǎng)間濕度40.0%～70.0%；換氣次數(shù)≥15次/h；動(dòng)物照明，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。

2 方法

2.1 給藥劑量

五加參歸芪精產(chǎn)品說明書用法與用量為口服，1～2次/d，10 mL/次，即臨床服用劑量為10～20 mL/d，每人按平均60 kg體質(zhì)量計(jì)算，每日服用10 mL，折算小鼠劑量為1.52 mL/kg；每日服用20 mL，折算小鼠劑量為3.03 mL/kg。因此，本研究設(shè)置0.76、1.52、3.03、6.06 mL/kg等4個(gè)考察劑量組。

陽性藥為人參口服液，產(chǎn)品用法與用量為口服，10 mL/次，3次/日，即每日服用30 mL，折算小鼠劑量為4.55 mL/kg。

藥物配制：取適量藥品溶液，采用生理鹽水稀釋至給藥濃度，小鼠灌胃體積為20 mL/kg。

2.2 實(shí)驗(yàn)造模及分組給藥

本實(shí)驗(yàn)0～16 d為造模期，從第17 天起給藥，連續(xù)7 d，第24天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)造模0～16 d：①從第1天起，給予小鼠基礎(chǔ)量進(jìn)食，即每天15 g飼料/100 g體質(zhì)量，共16 d；②從第1天起，每日在30 ℃恒溫水中負(fù)重游泳至力竭為止(負(fù)重為小鼠體質(zhì)量的5%，力竭標(biāo)準(zhǔn)為動(dòng)作明顯失調(diào)、慌張、鼻部在水面上下浮動(dòng))，共13 d；③從第13天起，每日灌服心得安溶液5 mL/kg(折算心得安片24 mg/kg，生理鹽水配制)，連續(xù)4 d，至第16天[8-11]。

分組給藥：ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)選取12只作為正常組，自由飲食，從第13天起，每日灌服生理鹽水5 mL/kg，連續(xù)4 d，至第16天，從第17天起，灌服生理鹽水20 mL/kg，連續(xù)7 d，第24天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。其余均為造模組，按上述方法造模，第17天隨機(jī)抽取12只作為模型組，其余隨機(jī)分為5組，即五加參歸芪精4個(gè)劑量組及陽性藥組，以20 mL/kg體積灌胃給與對(duì)應(yīng)藥物，連續(xù)7 d，至第24天實(shí)驗(yàn)結(jié)束；模型組連續(xù)7 d灌胃20 mL/kg生理鹽水。上述各實(shí)驗(yàn)組小鼠，雌雄各半，單籠飼養(yǎng)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

于第24天，測(cè)定游泳力竭時(shí)間，而后摘除眼球取血，3 000 r/min離心10 min收集血清，采用試劑盒測(cè)定TNF-α及IL-2，根據(jù)使用說明書進(jìn)行操作；取心臟，留取一半用于心肌病理切片，另外一半心肌組織勻漿，檢測(cè)LDH、CK、SOD、MDA，根據(jù)使用說明書進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 小鼠存活情況

本研究采用“基礎(chǔ)進(jìn)食+負(fù)重游泳+灌服心得安”方法復(fù)制小鼠心氣虛模型，考察五加參歸芪精改善心氣虛的量效關(guān)系，在造模負(fù)重游泳過程中及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢測(cè)游泳力竭時(shí)間，會(huì)有小鼠因力竭嗆水死亡，各組存活小鼠情況統(tǒng)計(jì)見表1，以下各指標(biāo)測(cè)定以存活小鼠計(jì)算。

表1 小鼠存活情況

3.2 一般情況及體征

與正常組比較，模型組小鼠從初期的覓食活動(dòng)增強(qiáng)、頻咬鐵籠，到逐漸安靜，而后出現(xiàn)精神不振、活動(dòng)減少、毛松、眼眶變小、鼠尾顏色淡白、拱肩縮背、行動(dòng)遲緩，尤其從第13天起連續(xù)灌服心得安后，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、倦怠，尤以強(qiáng)迫活動(dòng)后為甚。上述癥狀符合小鼠心氣虛模型的癥狀體征。

3.3 游泳力竭時(shí)間測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，與正常組比較，模型組游泳力竭時(shí)間顯著縮短(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組顯著延長小鼠游泳力竭時(shí)間(P<0.05)，五加參歸芪精3.03、6.06 mL/kg劑量組顯著延長小鼠游泳力竭時(shí)間(P<0.05)，0.76、1.52 mL/kg劑量組無顯著性差異(P>0.05)。

3.4 血清TNF-α、IL-2測(cè)定結(jié)果

TNF-α：與正常組比較，模型組TNF-α顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組TNF-α顯著降低(P<0.05)，五加參歸芪精3.03、6.06 mL/kg劑量組TNF-α顯著降低(P<0.01)，0.76、1.52 mL/kg劑量組無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

IL-2：與正常組比較，模型組IL-2水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組IL-2顯著降低(P<0.05)，五加參歸芪精1.52、3.03、6.06 mL/kg劑量組IL-2顯著降低(P<0.05、P<0.01)，0.76 mL/kg劑量組無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 小鼠游泳力竭時(shí)間及血清TNF-α、IL-2測(cè)定結(jié)果

3.5 心肌CK、LDH測(cè)定結(jié)果

CK：與正常組比較，模型組CK顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組CK顯著降低(P<0.01)，五加參歸芪精3.03、6.06 mL/kg劑量組CK顯著降低(P<0.05，P<0.01)，0.76、1.52 mL/kg劑量組均無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

LDH：與正常組相比，模型組LDH顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組LDH顯著降低(P<0.01)，五加參歸芪精3.03、6.06 mL/kg劑量組CK顯著降低(P<0.05，P<0.01)，0.76、1.52 mL/kg劑量組均無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 小鼠心肌CK、LDH、SOD、MDA測(cè)定結(jié)果

3.6 心肌SOD、MDA測(cè)定結(jié)果

SOD：與正常組相比，模型組SOD顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組無顯著性差異(P>0.05)，五加參歸芪精0.76、3.03、6.06 mL/kg劑量組SOD顯著升高(P<0.01)，1.52 mL/kg劑量組無顯著性差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

MDA：與正常組相比，模型組MDA顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組無顯著性差異(P>0.05)；五加參歸芪精0.76、1.52、3.03、6.06 mL/kg四個(gè)劑量組MDA均顯著降低(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

3.7 心肌病理切片

正常組：心肌纖維排列規(guī)整，細(xì)胞核多位于肌纖維中央，多為一個(gè)，心肌間質(zhì)和心肌內(nèi)血管未見異常，心內(nèi)膜、外膜未見異常，為正常心肌結(jié)構(gòu)。見圖1。

模型組：出現(xiàn)心肌結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為心肌纖維排列不規(guī)則，肌纖維中度斷裂，心肌間質(zhì)和心肌內(nèi)血管輕度充血，心肌纖維可見淋巴細(xì)胞侵潤。見圖1。

陽性藥組及五加參歸芪精4個(gè)劑量組：各組小鼠心肌結(jié)構(gòu)損傷減輕，心肌纖維排列較規(guī)則，心肌內(nèi)血管充血及淋巴細(xì)胞侵潤減輕或恢復(fù)。見圖1。

綜上，五加參歸芪精具有改善小鼠心氣虛的藥效作用，綜合考察游泳力竭時(shí)間、血清IL-2、TNF-α、心肌LDH、CK、SOD、MDA及心肌病理切片等指標(biāo)，在設(shè)置的0.76、1.52、3.03、6.06 mL/kg 4個(gè)劑量條件下，藥效作用具有量效相關(guān)性，五加參歸芪精3.03、6.06 mL/kg劑量對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)均具有顯著改善，藥效作用顯著。

4 討論

在力竭運(yùn)動(dòng)所致心氣虛證造成小鼠心肌損傷的過程中，自由基損傷學(xué)說及炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用，因此測(cè)定自由基代謝水平及細(xì)胞炎性因子含量有重要意義[10]。SOD作為反映氧自由基清除能力的指標(biāo)，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡至關(guān)重要，MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的重要代謝產(chǎn)物，MDA含量可較好地反映組織脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細(xì)胞損傷程度，SOD活力降低，MDA含量升高，表明機(jī)體抗氧自由基攻擊的活性降低。五加參歸芪精0.76、3.03、6.06 mL/kg劑量組提高了心氣虛證小鼠心肌SOD活力、降低了MDA含量，表明其可通過改善小鼠心肌自由基代謝，增強(qiáng)心肌抗氧化能力、減少自由基損傷而保護(hù)心肌。TNF-α及IL-2是重要的細(xì)胞炎性因子，TNF-α及IL-2含量增加可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)損傷心肌。五加參歸芪精3.03、6.06 mL/kg劑量組降低了血清TNF-α、IL-2水平，表明其能夠抑制細(xì)胞炎性因子釋放而保護(hù)心肌。

CK和LDH是重要的心肌酶，當(dāng)心肌受損時(shí)CK、LDH因心肌細(xì)胞線粒體膜破裂而釋放，現(xiàn)已公認(rèn)心肌酶釋放是心肌受損害程度的標(biāo)志，因此檢測(cè)CK、LDH含量可作為觀察心肌受損的指標(biāo)[9]。五加參歸芪精3.03、6.06 mL/kg劑量組降低了心肌CK、LDH含量，表明其可有效改善心肌損傷。