人造雞肉的蛋白質(zhì)消化特性研究

林全全 劉璐颯 吳麗芳 蔡可騰 韓劍眾

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，杭州 310018) (杭州華測檢測技術(shù)有限公司2，杭州 310018)

人類食用蛋白質(zhì)來源主要是動植物性蛋白，其中，動物性蛋白的營養(yǎng)價值更高，但其所含的脂肪和膽固醇等對人體健康有不利影響。出于對環(huán)境可持續(xù)發(fā)展和動物福利的考慮，許多針對以動植物為食人群的肉類替代品和肉類仿真品，例如昆蟲蛋白、3D打印細(xì)胞培養(yǎng)肉和植物基人造肉(也稱植物蛋白肉或植物肉)隨之產(chǎn)生。其中，植物肉主要由組織化植物蛋白及香辛料、色素組成[1]。組織化植物蛋白是指以植物蛋白為主要原料，以淀粉、脂肪、纖維素等為輔料，通常采用擠壓法制得的類似動物肉纖維狀結(jié)構(gòu)和口感的蛋白產(chǎn)品[2]。未來植物肉或?qū)⑻娲糠謩游锶猓蔀槿祟愔饕牡鞍讈碓粗?。因此，研究植物肉的蛋白質(zhì)消化吸收特性，明確其能否滿足人們對蛋白質(zhì)的需求具有重要意義。

目前，有關(guān)植物肉的蛋白質(zhì)消化的研究報道還很少。研究表明，食品的消化特性受食品結(jié)構(gòu)的影響并隨食品結(jié)構(gòu)的改變而發(fā)生變化[3]。擠壓組織化過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生變性形成新的組織結(jié)構(gòu)，其在宏觀狀態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)上發(fā)生了較大變化。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)擠壓組織化得到的植物蛋白質(zhì)體外消化率高于原料蛋白質(zhì)(如大豆粕、大豆?jié)饪s蛋白)，推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化(即變性及纖維狀結(jié)構(gòu)的形成)以及抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解是蛋白質(zhì)消化率提高的主要原因[4,5]。目前有關(guān)植物肉中的蛋白質(zhì)消化特性與植物蛋白原料及模擬的動物肉蛋白的差異，以及植物肉中的蛋白質(zhì)在擠壓條件下形成的纖維結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)消化特性之間的相關(guān)性還不明確，亟待進(jìn)一步研究。目前，市面上最常見的植物肉大多由組織化大豆蛋白構(gòu)成。

本研究以基于組織化大豆蛋白的市售人造雞肉為主要研究對象，比較人造雞肉與雞肉纖維狀結(jié)構(gòu)之間的差異，以及人造雞肉與雞肉以及大豆蛋白的消化特性，建立纖維結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)消化特性的相關(guān)性，以期為開發(fā)高蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的植物肉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸脯肉；人造雞肉(配料：大豆分離蛋白，水，淀粉，植物油，釀造醬油，白砂糖，食用鹽，白胡椒；拉絲蛋白復(fù)水而成)：市售；大豆分離蛋白(SPI)。

唾液淀粉酶(10 U/mg)、胃蛋白酶(250 U/mg)、胰酶(其中的胰蛋白酶酶活為5.0 U/mg)；L-絲氨酸：分析純；過硫酸銨(A3678)和十二烷基硫酸鈉(L3771)：電泳專用試劑；牛膽鹽：生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT Plus型組織分析儀，MS3000型馬爾文激光粒度分析儀，KDN-816型定氮儀和HYP-320型消化爐，UV2100型紫外可見分光光度計和NE910型熒光正置顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

根據(jù)Chiang等[6]方法處理雞肉：將雞肉裝進(jìn)密封的塑料袋里，在沸水浴中煮熟至內(nèi)部溫度為75～80 ℃后(5～7 min)取出，室溫下冷卻30 min，瀝干，備用。

1.3.2 水分、pH、蛋白質(zhì)含量分析

水分測定參照GB/T 5009.3—2010中直接干燥法，稱取2 g樣品至恒重鋁盒中，再放入105 ℃烘箱烘干至恒重，記錄烘干前后的質(zhì)量并計算樣品含水量。

參考Chiang等[6]的方法測定人造雞肉和雞肉的pH值。使用高剪切混合器以24 000 r/min將質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%樣品與超純水混合1 min后，使用pH計測量pH值。

蛋白質(zhì)含量測定參照GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法，將樣品粉碎至適宜狀態(tài)顆粒后稱取0.3 g，利用凱氏定氮儀測定樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性分析

根據(jù)耿永然等[7]的方法，采用物性測定儀(TPA模式)測定人造雞肉和雞肉的硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼度和回復(fù)性。將樣品切成1.5 cm×1.5 cm×1 cm的小塊，置于測試臺中央，使用P50探頭，以1 mm/s的測試速度，將樣品下壓到原來厚度的50%，間隔時間3 s，往復(fù)2次。每個樣品至少測定12次。

1.3.4 組織化度測定

根據(jù)Zhang等[8]的方法將樣品切成1.5 cm×1.5 cm×1 cm的小塊，置于物性測定儀測試臺中央，用A/CKB探頭(刀片狀)以1 mm/s的速度對樣品進(jìn)行剪切，剪切厚度設(shè)定為樣品厚度的75%，剪切寬度均為1.5 cm。切片與模頭擠出方向平行時的剪切力縱向剪切力，垂直時為橫向剪切力，量綱為kg。每個樣品至少測定12次。組織化度的值為橫向剪切力與縱向剪切力的比值。

1.3.5 微觀結(jié)構(gòu)分析

將樣品復(fù)水瀝干后切成1 cm×1 cm×1 cm的正方體后用OCT包埋在凍存盒中，用液氮速凍后取出，放在冷凍切片機(jī)上，將樣品切成18 μm厚度的薄片，用載玻片吸附薄片后進(jìn)行光鏡觀察。

1.3.6 體外消化試驗

根據(jù)Brodkorb等[9]的胃腸道體外靜態(tài)消化模型配方，進(jìn)行前期準(zhǔn)備工作：1)進(jìn)行酶活性和膽汁濃度檢測；2)制備模擬唾液(SSF)、模擬胃液(SGF)和模擬小腸液(SIF)儲備液；3)進(jìn)行消化預(yù)實驗，確定各消化階段pH調(diào)整所需酸和堿的添加量。

隨后進(jìn)行消化實驗并獲得消化產(chǎn)物，具體操作為：1)口腔階段：采用粉碎機(jī)攪打樣品模擬咀嚼。根據(jù)樣品蛋白質(zhì)含量分別稱取攪打后的樣品至50 mL錐形瓶中，保持每組樣品中蛋白質(zhì)含量[(0.85±0.01 g)]一致，并補(bǔ)充適量蒸餾水至5 g。然后，加入5 mL SSF，調(diào)整pH至7.0。添加唾液α-淀粉酶液和CaCl2，使其在最終混合物中的濃度分別達(dá)到使達(dá)到75 U/mL和0.75 mmol/L。將樣品置在37 ℃軌道搖床中100 r/min下孵育2 min；2)胃階段：將口腔消化后的食團(tuán)與10 mL SGF混合，pH調(diào)整為3.0。加入胃蛋白酶，使其在混合物中濃度為2 000 U/mL，然后加入CaCl2溶液，使其在最終混合物中達(dá)到0.075 mmol/L，模擬的消化物在100 r/min的攪拌下于37 ℃水浴中孵育。分別在30、60和120 min收集胃消化食糜，分別記為SGF-30，SGF-60和SGF-120。3)小腸階段：將模擬胃消化物與20 mL SIF混合，然后將pH值調(diào)整為7.0。加入膽汁鹽和胰酶(預(yù)先溶解在SIF中)在最終混合物中分別達(dá)到10 mmol/L和100 U/mL的胰蛋白酶活性。添加CaCl2以在最終混合物中達(dá)到0.3 mmol/L。模擬的消化物在100r/min的攪拌下于37 ℃孵育。在小腸模擬消化的第30、60和120 min收集樣品，分別記為SIF-30、SIF-60和SIF-120。

1.3.7 粒徑測定

消化完成后，取適量樣品的口腔消化產(chǎn)物、SGF-120和SIF-120，攪勻后立即用馬爾文激光粒度儀測定粒度大小和分布。

1.3.8 可溶性氮含量測定

取各個階段的消化產(chǎn)物，4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，取上清液，利用凱氏定氮法測定樣品的可溶性氮含量。同時，將未消化的原始樣品與水以1∶1的比例混合，攪拌60 min，以10 000 r/min離心20 min，取上清液，利用凱氏定氮法測定未消化樣品中的可溶性氮含量。

1.3.9 SDS-PAGE電泳分析

根據(jù)Tian等[10]的方法選用12%分離膠和5%濃縮膠，考馬斯亮藍(lán)G-250染色。上樣液的配置：取各階段消化產(chǎn)物與上樣緩沖液(樣品緩沖液+體積分?jǐn)?shù)3%二硫蘇糖醇)以1∶1比例混合，加入轉(zhuǎn)子攪拌3 h至蛋白完全溶解，然后超聲5 min，95 ℃水浴中加熱5 min，10 000 r/min離心15 min，取10 μL上清液注入泳道，接通電源，在恒壓125 V下跑膠。

1.3.10 游離氨基酸組成分析

采用L8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行各氨基酸組分的測定。其中，未消化的樣品粉末需參照GB/T 5009.124—2016方法對樣品進(jìn)行酸水解處理。消化產(chǎn)物樣品經(jīng)10 000 r/min離心15 min，取上清液，再加入5%磺酸水楊酸沉淀蛋白(1∶4)，用高速冰凍離心機(jī)18 000 r/min離心30 min，取上清液經(jīng)濾膜(0.45 m+0.22 m)過濾后上機(jī)分析。平行測定2次，以平均值作為實驗結(jié)果。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

除特殊說明外，所有實驗至少進(jìn)行3次，實驗結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、處理和作圖，各組數(shù)據(jù)中的顯著性差異采用Excel中單因素方差分析進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 人造雞肉和雞肉的基本成分和纖維結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 人造雞肉和雞肉的水分、pH、蛋白質(zhì)含量比較

從表1可知雞肉的水分和蛋白質(zhì)含量都明顯高于人造雞肉，pH低于人造雞肉，可能是由于人造雞肉的加工過程中添加了較多的淀粉、脂類等其他原料以滿足其外觀與口感，這些添加物直接或間接影響了其基本成分的變化。

表1 人造雞肉和雞肉的水分、pH及蛋白質(zhì)含量

2.1.2 人造雞肉和雞肉的纖維結(jié)構(gòu)分析

由表2可見，人造雞肉的硬度和回復(fù)性低于雞肉，而彈性、內(nèi)聚性和咀嚼度高于雞肉?？赡苡捎谌嗽祀u肉中添加較多的淀粉，淀粉的膨化作用增大了人造雞肉組織結(jié)構(gòu)間縫隙，使得其硬度和回復(fù)性較低，而彈性較高。

組織化度為橫向剪切力(FV)和縱向剪切力(FL)的比值，它是纖維結(jié)構(gòu)形成的指標(biāo)，表現(xiàn)為無量綱值> 1，這是因為垂直于纖維方向切割需要更高的切割阻力，而平行于纖維方向切割則需要較低的切割阻力。由表3可知人造雞肉的橫向剪切力、縱向剪切力及組織化度均略小于雞肉，但是無顯著性差別，表明人造雞肉能較好地模擬雞肉的纖維結(jié)構(gòu)。

表2 人造雞肉和雞肉的結(jié)構(gòu)特性

表3 人造雞肉和雞肉的橫縱向剪切力及組織化度

人造雞肉和雞肉的纖維結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微圖如圖1所示，二者均顯示出纖維狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。人造雞肉的纖維較粗，分布較為不均勻和松散，且纖維與纖維之間的間隙較大；而雞肉的肌肉纖維較細(xì)，且分布密集均勻和規(guī)則，纖維與纖維之間的間隙較小。相比之下，Chiang等[6]報道采用大豆和小麥蛋白為主要原料制備的高水分組織蛋白的纖維比雞肉纖維更細(xì)，連接更緊密，產(chǎn)生的差異可能與其組成和加工工藝有關(guān)。

圖1 人造雞肉和雞肉的光學(xué)纖維圖

2.2 人造雞肉的蛋白質(zhì)消化特性研究

2.2.1 粒徑大小及變化

食品在消化過程中的粒徑大小及分布變化可以反映其消化分解速度。由表4和圖2可知，經(jīng)過體外模擬消化，人造雞肉、雞肉和SPI的粒徑大小均呈減小趨勢，且在消化的不同階段，3種樣品的粒徑均有顯著性差異。口腔消化后，樣品的D4,3排列順序為人造雞肉>雞肉>SPI，其中，人造雞肉和雞肉的粒徑呈雙峰分布，而SPI呈單峰分布(圖2)。人造雞肉與雞肉的粒徑差異可能歸因于它們自身的結(jié)構(gòu)特性，食品質(zhì)構(gòu)會影響其咀嚼特性。通常硬度越大的食品經(jīng)咀嚼得到的食糜粒徑越?。挥捕仍叫【捉浪玫氖趁恿絼t越大[11]。本研究中，人造雞肉經(jīng)模擬咀嚼得到的粒徑大于雞肉，這可能是因為其硬度較小。SPI在口腔消化結(jié)束后食糜的粒徑最小，這可能是因為其本身呈粉末狀，顆粒較小，水溶性較好，可均勻分散在消化液中。

表4 人造雞肉、雞肉和SPI消化過程中粒徑大小

圖2 消化過程中的粒徑分布

胃消化120 min后，3個樣品的消化產(chǎn)物粒徑均大大減小，這是由于經(jīng)胃蛋白酶消化使得蛋白質(zhì)分解成多肽和游離氨基酸。樣品的D4,3排列順序與口腔階段一致。人造雞肉的粒徑大小和分布從口腔到胃的階段變化最大，其次是雞肉，SPI變化最小，這說明人造雞肉在胃蛋白酶的作用下分解較快，大顆粒減少，但其所含大顆粒仍比雞肉和SPI的多(圖2b)。

小腸消化120 min后，三者消化產(chǎn)物的粒徑進(jìn)一步減小，這是因為在胰蛋白酶作用下，蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生進(jìn)一步水解生成小肽和游離氨基酸。食糜的D4,3排列順序與前兩階段不同，其中，SPI的D4,3值最大，人造雞肉的最小，這說明小腸階段人造雞肉的消化引起的粒徑變化較另兩者的大，且消化產(chǎn)物粒徑較??；而SPI的粒徑變化最小，消化產(chǎn)物粒徑較大，這可能是因為胰酶中包含淀粉酶，而人造雞肉的組成中有淀粉。因此，在蛋白酶和淀粉酶的共同作用下，人造雞肉在小腸階段的粒徑變化較大。相比之下，雞肉和SPI主要以蛋白質(zhì)為主，二者粒徑變化較小。

結(jié)果表明，在胃腸消化過程中，人造雞肉由于硬度較小在口腔消化階段的粒徑較大；在胃和小腸的消化過程中，相對于雞肉與SPI，人造雞肉的粒徑變化最大，這可能與其蛋白纖維結(jié)構(gòu)及組成有關(guān)。

2.2.2 消化過程中蛋白質(zhì)分子量的變化

由圖3比較三組樣品消化前組成亞基(泳道1)可得，人造雞肉(圖3a)中可鑒定出大豆蛋白的組成亞基，包括β-伴大豆球蛋白(α、α′和β 3種亞基)、大豆球蛋白的酸性亞基和堿性亞基，進(jìn)一步說明人造雞肉的蛋白質(zhì)來源于大豆。雞肉(圖3b)中出現(xiàn)大于97.2 ku的條帶，對應(yīng)雞肉肌原纖維蛋白中的肌球蛋白的2個重鏈[12]，在44.3～66 ku之間存在的若干條帶對應(yīng)肌動蛋白。此外，雞肉中還存在著若干分子量小于44.3 ku的條帶，對應(yīng)肌球蛋白的輕鏈和肌鈣蛋白，其他條帶可能是肌原纖維蛋白的碎片。SPI(圖3c)中顯示SPI與人造雞肉具有相似的電泳條帶。兩者的條帶略有差別，這可能是由于人造雞肉中的蛋白質(zhì)經(jīng)過擠壓加工，蛋白質(zhì)發(fā)生部分聚合和分解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子量發(fā)生略微變化。

比較可得人造雞肉、雞肉與SPI均在胃蛋白酶的作用下，大分子量的蛋白質(zhì)亞基降解為較小分子量的肽段。胃30～120 min時，SPI中大于29.0 ku的條帶顏色較淺，而另兩者中大于29.0 ku的條帶顏色很深，說明胃消化階段SPI的蛋白質(zhì)消化程度可能較大。進(jìn)入小腸消化階段后，三者基本都水解為小于14.3 kDa的肽段和氨基酸，且SPI的條帶顏色較淺，表明小腸階段SPI的蛋白質(zhì)消化可能較大。

注：泳道1～7分別代表消化前樣品；胃消化30、60和120 min；小腸消化30、60和120 min圖3 種樣品消化過程中SDS-PAGE圖譜

2.2.3 消化過程中可溶性氮含量變化

由圖4可得未消化的樣品中，SPI中的可溶性氮含量最高，雞肉次之，人造雞肉最低。人造雞肉由大豆蛋白加工而成，其可溶性氮含量小于SPI，這可能是由于在擠壓過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的交聯(lián)聚合反應(yīng)，生成一些相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)，導(dǎo)致其不能溶解[13]，從而使得可溶性蛋白質(zhì)含量降低，這與康立寧[14]的研究結(jié)果一致。

隨著消化反應(yīng)的進(jìn)行，人造雞肉、雞肉和SPI中蛋白質(zhì)不斷降解，消化產(chǎn)物中可溶性氮含量均不斷增加。由圖4可知，胃部消化30 min和小腸消化10 min后3種樣品的可溶性氮含量均顯著增大，說明消化主要發(fā)生在胃和小腸的初期。胃消化期間，人造雞肉的可溶性氮含量高于雞肉，這與其消化前相反，說明在胃消化階段中，基于大豆蛋白的人造雞肉迅速消化，與雞肉相比生成了更多的可溶性氮。這與粒徑變化結(jié)果相對應(yīng)，即人造雞肉在胃部消化程度較雞肉高，生成的可溶性氮較多，從而導(dǎo)致消化產(chǎn)物的粒徑迅速減小，這可能與它們的纖維狀結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。微觀圖像顯示人造雞肉的纖維較為松散，且纖維與纖維之間的間隙較大，有利于消化酶的滲入并促進(jìn)消化分解。而雞肉的纖維較細(xì)，分布較為密集，纖維與纖維之間的間隙較小，不利于消化酶的滲入，從而不利于蛋白質(zhì)的消化水解。經(jīng)過小腸消化10 min后，3種樣品的可溶性氮含量進(jìn)一步增大，隨后人造雞肉和SPI的可溶性氮含量增長緩慢并逐漸趨于平穩(wěn)，而雞肉的可溶性氮含量仍增長較快，并在小腸消化60 min后趨于平穩(wěn)。在小腸消化階段，3種樣品的可溶性氮含量大小順序為：SPI>雞肉>人造雞肉。三者可溶性氮含量的生成特性的差異可歸因于其不同的組成及結(jié)構(gòu)特性。

注：相同時間段不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。圖4 人造雞肉、雞肉和SPI消化過程中可溶性氮含量

2.2.4 游離氨基酸組成分析

由表5可得，樣品經(jīng)胃部和小腸消化120 min后游離氨基酸的組成均有很大差異，但17種主要氨基酸的總量為：SPI>雞肉>人造雞肉，這與3組樣品在小腸階段的可溶性氮含量結(jié)果一致，可能是由于SPI是粉末狀固體顆粒，大部分可溶于水，與蛋白酶的接觸面積較大，蛋白質(zhì)水解較徹底；而人造雞肉是一種添加了淀粉、油脂等的大豆蛋白擠壓產(chǎn)物，加工過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性并形成纖維結(jié)構(gòu)，可溶性蛋白含量和某些氨基酸減少。前人研究發(fā)現(xiàn)，擠壓加工會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的完整性損失，暴露出新的蛋白水解酶作用位點，減少或消除了不同的抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而提高大豆蛋白的消化率[15-17]。然而，本研究中的人造雞肉蛋白質(zhì)的消化程度低于大豆蛋白，可能是因為人造雞肉中的纖維結(jié)構(gòu)及存在的其他物質(zhì)(淀粉、油脂等)阻礙了酶與蛋白的接觸，從而降低蛋白質(zhì)消化率。

表5 三組樣品消化后游離氨基酸組成

3 結(jié)論

人造雞肉與雞肉的質(zhì)構(gòu)特性、組織化度較為接近，說明人造雞肉較好地模擬了雞肉的產(chǎn)品特性，但兩者的纖維結(jié)構(gòu)仍存在較大差異，其中人造雞肉的纖維較粗，分布不均勻和松散，纖維之間的間隙較大；而雞肉的肌肉纖維較細(xì)，且分布密集均勻和規(guī)則，纖維之間的間隙較小。體外消化結(jié)果顯示，與雞肉相比人造雞肉的纖維間空隙較大，有利于消化，但其蛋白與消化酶的親和力較小，導(dǎo)致生成的氨基酸較少。與原料蛋白相比，人造雞肉中的大豆蛋白經(jīng)擠壓后形成的纖維狀結(jié)構(gòu)不利于蛋白質(zhì)的消化。人造雞肉能夠模擬雞肉的產(chǎn)品特性，但由于其蛋白質(zhì)消化率低于雞肉與原料蛋白質(zhì)，后續(xù)還需對植物肉的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，從而提高其蛋白質(zhì)消化程度，以期獲得與肉類相同的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值。