復(fù)合瑪咖片的毒理學(xué)安全性評價

張 悅 張朋朋 孟慶金 董 鵬 楊彩玲 王學(xué)南 張 鵬 田世民,

瑪咖是十字花科獨行菜屬一年生或兩年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯，是南美洲安第斯山地區(qū)常用的藥食兩用植物之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，瑪咖中存在多種活性物質(zhì)，包括嗎卡多糖、瑪咖生物堿、瑪咖芥子油苷、瑪咖黃酮等，具有增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、降血糖及神經(jīng)保護(hù)等功效[2]。黃芪屬植物在我國超過200余種，是我國傳統(tǒng)的中藥材，主要活性成分有黃酮、三萜及生物堿等，具有抗菌、炎癥抑制、抗氧化、降脂、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等功效[3]。沙苑子是豆科植物扁莖黃芪干燥成熟的種子，也是我國傳統(tǒng)的中藥材，主要含有有黃酮、三萜、氨基酸等活性成分，具有護(hù)肝降脂、提高免疫力、抗氧化、耐疲勞等作用[4，5]。女貞子是女貞屬植物的果實，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載，女貞屬植物主要含有主要含有萜類、苯乙醇類、黃酮類等成分，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎及保肝等功效[6]。黃精為百合科黃精屬多年生草本植物的干燥根莖，是我國傳統(tǒng)中藥材，含有黃精多糖、皂苷、生物堿、黃酮、蒽醌類化合物、氨基酸、微量元素等多種活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、降血糖、降血脂、抗氧化、改善記憶、抗腫瘤等多種功效[7，8]。

復(fù)合瑪咖片以瑪咖粉、黃芪提取物、沙苑子提取物、女貞子提取物、黃精提取物為主要原料制備的片劑保健食品，具有緩解體力疲勞功效。本研究按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》對復(fù)合瑪咖片進(jìn)行安全性評價，為其作為保健食品的食用安全性提供實驗依據(jù)。

1.實驗材料

1.1 受試物 復(fù)合瑪咖片，規(guī)格：0.5g/片×60片/瓶，人體推薦食用方法及食用量：口服，每日2次，每次3片。

1.2 實驗動物及菌株 SPF級ICR小鼠、SD大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016—0011。動物飼養(yǎng)管理條件：溫度20～26℃，濕度40%～70%，光照12h明暗交替。動物飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號：SCXK(京)2014—0010。本單位實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2016—0011。鼠傷寒沙門菌株TA100購買自廣東省微生物菌種保藏中心，TA97a、TA98、TA102購買自MOLTOX公司。

1.3 主要儀器與試劑 血液分析儀(雅培CELL-DYN3700)，全自動生化儀(東芝TBA-120FR)，電子天平(Sartorius BS 223S，Sartorius BSA2202s-cw，METTLER ME203E/02)，離心機(jī)，顯微鏡(奧林巴斯CX31)，石蠟切片機(jī)，脫水機(jī)等。

肝S9購買自MOLTOX公司，批號：3745；敵克松(Dexon)購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號：40709；疊氮鈉(SA)購自Amresco公司，批號0639；2-氨基芴(2-AF)購自Sigma公司，批號：AG310001；1,8-二羥基蒽醌(1,8-DHQ)購自ACROS公司，批號：A0248756；環(huán)磷酰胺(CP)購自Sigma公司，批號：WXBC4021V。

2.實驗方法

2.1 急性毒性實驗 選用20只健康小鼠，雌雄各半，體重18～22g，采用最大耐受劑量法(MTD)進(jìn)行實驗。實驗前禁食不禁水16h，給受試物當(dāng)日標(biāo)記、稱重，稱取受試物7.5g，加適量去離子水充分混懸后定容至25ml，采用24h內(nèi)兩次經(jīng)口灌胃，灌胃間隔4h，單次灌胃體積為30ml/(kg·BW)，合計灌胃劑量為18.0g/(kg·BW)。末次灌胃2h后給予飼料；灌胃后0.5h、2h觀察，其后每天觀察1次、連續(xù)觀察14天，記錄動物中毒表現(xiàn)和死亡情況。

2.2 Ames實驗 采用經(jīng)鑒定符合要求的組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四個菌株進(jìn)行實驗。實驗設(shè)置5個劑量組，終劑量濃度依次為62μg/皿、185μg/皿、556μg/皿、1667μg/皿、5000μg/皿。采用平板摻入法：在頂層瓊脂(2ml，45℃)中依次加入0.1ml供試菌液、0.1ml受試物溶液，需代謝活化時另加入0.5mlS9混合液，充分混勻后迅速傾入底層培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。每個劑量設(shè)置3個平行皿，整個實驗在相同條件下開展2次。

2.3 骨髓細(xì)胞微核實驗 選用50只健康小鼠，體重25～30g，隨機(jī)分為5組，雌雄各半。實驗設(shè)置3個劑量組，按照一次最大灌胃劑量設(shè)置高劑量為6.0g/(kg·BW)，中劑量為3.0g/(kg·BW)，低劑量為1.5g/(kg·BW)，受試物以去離子水為溶劑，按20ml/(kg·BW)灌胃。采用30h兩次給予受試物法，即間隔24h兩次經(jīng)口灌胃，第二次給予受試物后6h，脫頸處死動物，取股骨骨髓用小牛血清稀釋后涂片，甲醇固定，Giemsa染色。顯微鏡檢，計數(shù)每只動物200個紅細(xì)胞(RBC)中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)(PCE)，計算所占比例；每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞中微核細(xì)胞數(shù)，其微核發(fā)生率以千分率計。實驗同時設(shè)置溶劑對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組[60mg/(kg·BW)]。

2.4 小鼠精子畸形實驗 選用25只健康雄性小鼠，體重25～35g，隨機(jī)分為5組。實驗設(shè)置3個劑量組，按照一次最大灌胃劑量設(shè)置高劑量為6.0g/(kg·BW)，中劑量為3.0g/(kg·BW)，低劑量為1.5g/(kg·BW)，受試物以去離子水為溶劑。按20ml/(kg·BW)灌胃，連續(xù)5天經(jīng)口灌胃，首次給予受試物后第35天，脫頸處死動物，取雙側(cè)附睪放入生理鹽水中，剪碎，四層擦鏡紙過濾，取濾液涂片，甲醇固定，2%伊紅染色。顯微鏡檢，每只動物計數(shù)1000個精子，并計算精子畸形發(fā)生率，以千分率計。

2.5 30天喂養(yǎng)實驗 選用SD大鼠80只，體重60～80g，隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半，1.25g/(kg·BW)、2.5g/(kg·BW)、5.0g/(kg·BW)，相當(dāng)于人體推薦劑量的25倍、50倍、100倍，另設(shè)溶劑對照組，連續(xù)經(jīng)口灌胃30天喂養(yǎng)。實驗期間每周稱量動物體重1次，攝食2次，并計算動物增重及食物利用率。連續(xù)喂養(yǎng)30天后，過夜禁食16h后稱重、麻醉，腹主動脈采血，進(jìn)行血常規(guī)和血生化測定，并對動物進(jìn)行大體解剖及組織病理學(xué)檢查。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。微核率和精子畸形率使用χ2檢驗進(jìn)行分析，其他各指標(biāo)均使用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1 急性毒性實驗 受試物以18.0g/(kg·BW)的劑量經(jīng)口灌胃給予雌、雄性ICR小鼠，連續(xù)觀察14d，動物糞便、體毛、活動正常，動物體重變化未見異常，實驗期間未見其他明顯的動物中毒癥狀和死亡。結(jié)果表明該受試物對雌、雄性ICR的急性經(jīng)口毒性最大耐受劑量(MTD)大于18.0g/(kg·BW)。

3.2 遺傳毒性實驗

3.2.1 Ames實驗：各處理組平板背景菌苔未見異常。受試物各劑量組回變菌落數(shù)均未超過未處理對照菌落數(shù)2倍，不同劑量組間無劑量-反應(yīng)關(guān)系，兩次結(jié)果一致；在加和不加S9條件下，均未見受試物對TA97a、TA98、TA100、TA102四株菌有致突變作用。

3.2.2 骨髓細(xì)胞微核實驗：由表1可見，受試物各劑量嗜多染紅細(xì)胞(PCE)與紅細(xì)胞百分比未少于溶劑對照組的20%，表明受試物在實驗劑量下無明顯細(xì)胞毒性；受試物各劑量組的微核發(fā)生率與溶劑對照組相比，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；提示該受試物對小鼠骨髓細(xì)胞無致微核作用。

表1 受試物對小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響

3.2.3 小鼠精子畸形實驗：由表2可見，與溶劑對照組相比，受試物各劑量組均未見精子畸形發(fā)生率有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，提示受試物對小鼠無致精子畸形作用。

表2 受試物對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

3.3 30天喂養(yǎng)實驗

3.3.1 受試物對大鼠體重、攝食的影響：不同劑量連續(xù)經(jīng)口灌胃SD大鼠30天，雌、雄性大鼠的周體重和攝食量逐周增加，周體重增重與周食物利用率逐周減少(表3)，由此說明大鼠體重與攝食量成正相關(guān)，大鼠的體重與食物利用率成負(fù)相關(guān)。與對照組相比，雄性動物中劑量組第4周動物平均體重較輕，表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。受試物各劑量組各周攝食量、周平均食物利用率與對照組相比，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表3 受試物對大鼠體重、攝食的影響

3.3.2 受試物對大鼠血液生化指標(biāo)的影響：雌性動物低劑量組動物白細(xì)胞計數(shù)較對照組偏高，高劑量組白細(xì)胞其他分類較對照組偏低，均表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；雄性動物低劑量組紅細(xì)胞計數(shù)及淋巴細(xì)胞較對照組有所升高，中性粒細(xì)胞較對照組偏低，均表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)，其他各指標(biāo)在不同劑量組與對照組間比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表4。雌性動物受試物低劑量組血糖較對照組偏低，并表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其他各指標(biāo)在不同劑量組與對照組間比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表5。

表4 受試物對大鼠血常規(guī)的影響

續(xù)表4

表5 受試物對大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

3.3.3 大體解剖及組織學(xué)病理檢查：大鼠大體解剖肉眼觀察，高劑量組雄性1例動物可見睪丸萎縮，其余各劑量組肝、腎、脾、胃腸、睪丸或卵巢臟器未見明顯異常，取對照組和高劑量組雌性及雄性動物相關(guān)組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。對照組有雌性1例、雄性2例，高劑量組有雌性2例、雄性2例肝細(xì)胞索之間和(或)匯管區(qū)偶見輕微的灶性單核細(xì)胞浸潤，該病變屬SD大鼠常見的自發(fā)性改變；另外對照組雌性1例，高劑量組雌性2例發(fā)生輕微脂肪性變。高劑量組1例動物睪丸萎縮，鏡檢可見生精上皮層次減少，生精小管未見成熟精子，間質(zhì)細(xì)胞增生，被膜增厚。腎臟、脾臟、胃、十二指腸、卵巢均未見異常。

4.結(jié)論

本研究對以瑪咖粉、黃芪提取物、沙苑子提取物、女貞子提取物、黃精提取物為主要原料制備的保健食品復(fù)合瑪咖片進(jìn)行了毒理學(xué)研究，急性毒性實驗結(jié)果顯示該受試物對ICR小鼠的急性經(jīng)口毒性最大耐受劑量(MTD)大于18.0g/(kg·BW)，屬于實際無毒級。Ames實驗、骨髓細(xì)胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗結(jié)果均為陰性，顯示本實驗條件下該受試物無遺傳毒性。30天喂養(yǎng)實驗結(jié)果表明，受試物復(fù)合瑪咖片各劑量組實驗期間雌、雄性動物生長狀況良好，未見受試物對動物體重、增重及食物利用率產(chǎn)生不良影響，個別指標(biāo)差異無劑量-反應(yīng)關(guān)系，結(jié)合臨床觀察及病理診斷結(jié)果綜合分析，不認(rèn)為有生物學(xué)意義。未見受試物對動物血液學(xué)、血生化相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生不良影響，個別指標(biāo)差異無劑量-反應(yīng)關(guān)系，指標(biāo)檢測結(jié)果均在本實驗室歷史對照范圍內(nèi)，結(jié)合臨床觀察及病理診斷結(jié)果綜合分析，不認(rèn)為有生物學(xué)意義。大體解剖檢查，各劑量組動物均未見臟器明顯異常，不認(rèn)為受試物對被檢臟器濕重、臟體比產(chǎn)生不良影響，個別指標(biāo)差異無劑量-反應(yīng)關(guān)系，指標(biāo)檢測結(jié)果均在本實驗室歷史對照范圍內(nèi)，結(jié)合臨床觀察及病理診斷結(jié)果綜合分析，不認(rèn)為有生物學(xué)意義。組織病理學(xué)檢查，未見被檢臟器存在與受試物相關(guān)的組織病理學(xué)改變。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合瑪咖片在本實驗條件下未見明顯的毒性作用，為復(fù)合瑪咖片作為保健食品的進(jìn)一步開發(fā)提供毒性實驗依據(jù)。