黑色沖調(diào)粉加工過程中細菌與真菌菌群分析

王雅芳 何新益 于政紅 徐甜甜 吳海清

(1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300392)

目前，沖調(diào)粉作為新興以“營養(yǎng)、快捷”為主要賣點的代餐食品在市面上層出不窮，其中大多數(shù)沖調(diào)粉生產(chǎn)加工廠采用一體化管道輸送加工模式生產(chǎn)沖調(diào)粉，很大基礎(chǔ)上使沖調(diào)粉的生產(chǎn)變得更快捷[1-2]。但是，近年來有不少沖調(diào)粉微生物超標的報道，微生物生長繁殖到一定數(shù)量時會消耗沖調(diào)粉中營養(yǎng)物質(zhì)使其變質(zhì)，影響產(chǎn)品感官和品質(zhì)[3]。

生物危害主要是微生物對產(chǎn)品的危害。在沖調(diào)粉生產(chǎn)加工過程中加工方法、操作、設(shè)備等都可能導(dǎo)致微生物污染[4-5]。因此，若能明確沖調(diào)粉在實際加工過程中的微生物情況，找到加工過程中的關(guān)鍵污染源，加強制定針對微生物方面的管理制度，進而減少生產(chǎn)過程中的微生物數(shù)量，從根本降低產(chǎn)品因微生物污染所造成的質(zhì)量風(fēng)險[6]。

文章擬從黑色沖調(diào)粉加工的實際情況出發(fā)，測試各個環(huán)節(jié)原料、設(shè)備、車間空氣的微生物情況，結(jié)合高通量測序[7]的方法對加工各點的原料進行取樣分析，了解實際生產(chǎn)中各加工點的微生物物種分布情況，針對實際生產(chǎn)加工中微生物的消長規(guī)律，提出能夠減少加工過程中微生物含量的建議，為今后完善黑色沖調(diào)粉或相關(guān)產(chǎn)品的加工工序，實施減菌化技術(shù)及日后以微生物為主要觀察對象的信息化、動態(tài)監(jiān)控提供依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 試驗基地

某食品公司沖調(diào)粉標準化生產(chǎn)車間(凈度10萬級)。

1.2 主要試劑、儀器設(shè)備

PCA瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

基因擴增儀：My Cyler型，美國Bio-RAD公司；

超微量紫外分光光度計：ES-2型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品分組 將黑米、黑豆、黑棗、黑木耳、黑芝麻分別按1～5進行編號，原料記為A組，烘烤后記為B組，粉碎后記為C組，包裝前記為D組，包裝后記為E組，輻照殺菌后記為F組。

1.3.2 菌落總數(shù)測定 按GB 4789.2—2016執(zhí)行。

1.3.3 微生物取樣 按加工過程在清洗車、傳送帶、烘烤托盤、盛料筒、炒芝麻機、粗粉機、中粉機、微粉機、芝麻粉碎機、混料機、包裝機1、包裝機2、工人手皮膚表面(包裝間)、工人手皮膚表面(粉碎間)等部位取樣。將取樣框壓在檢測部位上，用無菌生理棉球沾無菌生理鹽水潤濕后，在框內(nèi)順序涂抹，每個待檢點表面選擇4個部位，一個棉球?qū)?yīng)一個部位，棉球不能重復(fù)使用，棉球使用后即刻放入100 mL無菌水瓶中，同時密封、搖勻，低溫運輸至實驗室分析。用無菌水進行梯度稀釋，計算1 cm2的含菌量，換算成lg(CFU/cm2)。培養(yǎng)37 ℃、48 h后計數(shù)。

1.3.4 車間空氣微生物測定 采用空氣自然沉降法[9]，在清洗間、挑選間、暫存間、脫包間、烘干間、粉碎間、混料間、包裝間、參觀通道中用直徑90 mm營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，參照GB/T 18204—2013進行布點，打開培養(yǎng)基在空氣中暴露15 min，隨即加蓋，37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.5 高通量測序法測定加工過程中的原料菌群變化

(1)原料總DNA提?。悍謩e在實際加工車間進行現(xiàn)場取樣，嚴格按照DNA試劑盒的操作需求進行取樣，取回后置于-20 ℃的冷庫中貯藏，由北京奧維森基因科技有限公司專人冷鏈運輸至公司進行測序。

(2)細菌、真菌菌群變化：將樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop檢測樣品質(zhì)量，取30 ng進行PCR擴增，為使分析結(jié)果更加準確、可靠，測序原始數(shù)據(jù)下機后，對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優(yōu)化序列，然后進行OTU聚類及注釋?；诰垲惤Y(jié)果，可以進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析；基于注釋結(jié)果，可以得到各水平的分類信息，從而進行樣本組成及樣本間群落結(jié)構(gòu)差異相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沖調(diào)粉加工過程各工序原料菌落總數(shù)分布

黑色沖調(diào)粉中黑米、黑豆、黑棗、黑木耳的烘烤溫度分別為100，120，120，80 ℃。由圖1可知，烘烤對5種原料中的菌落總數(shù)均有較好的抑制作用，菌落總數(shù)均大幅度減少，但經(jīng)粉碎后，原料粉菌落總數(shù)又有所提升，因此推測粉碎這一加工工序是影響菌落總數(shù)的主要因素之一，原料中的內(nèi)生菌在加工過程中進入沖調(diào)粉。此外，與未包裝的沖調(diào)粉相比，包裝后的沖調(diào)粉菌落總數(shù)更高，包裝過程中可能會受到微生物污染，使成品菌落總數(shù)增加，說明包裝的微生物控制應(yīng)作為沖調(diào)粉加工過程中關(guān)鍵控制點。經(jīng)輻照殺菌[10]后菌落總數(shù)明顯下降，且數(shù)量未超過2 lg(CFU/g)，說明輻照可有效減少產(chǎn)品中的微生物，且最后成品測得菌落總數(shù)均符合國家標準。

圖1 加工過程中原料及產(chǎn)品中菌落總數(shù)

2.2 沖調(diào)粉加工過程操作器具菌落總數(shù)分布

由圖2可知，芝麻粉碎機、混料機和包裝機等對黑芝麻進行處理的機器中的菌落總數(shù)均>5.0 lg(CFU/cm2)，由此推測是因為黑芝麻中所含的油脂容易附著在機器內(nèi)壁上，使機器的清理變得困難，也更容易滋生微生物，因此清潔不徹底的粉碎設(shè)備和傳輸設(shè)備是微生物的主要來源。包裝機的菌落總數(shù)較高，表明包裝后產(chǎn)品的菌落總數(shù)增長的主要原因是來自于包裝機設(shè)備。此外，在包裝間和粉碎間進行搬運和混料的工人手表面的菌落總數(shù)也均>5.0 lg(CFU/cm2)，高于包裝間工人粉碎間工人手表面的，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)粉碎間的工人不僅要負責(zé)原料的粉碎，還需要對原料進行拆包、烘烤后的搬運等工作，對此建議增加工人數(shù)量，盡量做到一個車間一位主要負責(zé)的工人，這樣可以有效減少工人在不同車間來回工作時對原料的接觸，可采用有效的消毒液，監(jiān)督工人定時洗手，重點監(jiān)控粉碎間工人手部的衛(wèi)生狀況。

圖2 加工過程中操作器具及工人的菌落總數(shù)

2.3 沖調(diào)粉加工過程各車間空氣菌落總數(shù)分布

由圖3可知，沖調(diào)粉加工過程中各車間污染程度最高的粉碎間和混料間的菌落總數(shù)均>2.5 lg(CFU/cm2)，是因為這兩個車間主要進行的粉碎和混料容易造成粉末外溢；烘干間、包裝間和暫存間3個車間相對密閉且溫度較高，人員流動較多；清洗間和挑選間菌落總數(shù)較少，是因為這兩個車間經(jīng)常開窗換氣，且每次使用后會對車間進行清洗。因此，所有的車間除了要定時對相關(guān)設(shè)備進行清理外，也應(yīng)定時清潔地面、加強消毒和通風(fēng)工作。

圖3 加工過程中各車間空氣的菌落總數(shù)

2.4 16S rDNA細菌菌群分析

通過對序列進行聚類，對97%的相似水平的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析[11]，結(jié)果統(tǒng)計見表1。表1中沒有A2、B1、B2、B3樣品所對應(yīng)的OTU數(shù)，因為樣品在經(jīng)過PCR擴增后，PCR產(chǎn)物中無目的條帶或是濃度太低未能達到建庫要求，由此推斷，烘烤組的黑米、黑豆、黑棗在經(jīng)烘烤后微生物數(shù)量大幅度減少，且烘烤后的黑木耳、黑芝麻的OTU數(shù)(167，175)比原料中的(212，215)少很多，說明烘烤處理能夠起到一定減少或殺滅微生物的作用，是減少產(chǎn)品微生物的重要步驟。

表1 單個樣本的細菌菌群OTU數(shù)目統(tǒng)計

對單個樣品的OTU數(shù)按A～F進行分組，并繪制韋恩圖[12](見圖4)。由圖4可知，5組樣品中共有的OTU數(shù)為184個，E組與A、C、F組間沒有相同的OTU數(shù)，推測E組中所特有的OTU數(shù)可能是因來源不同(除原料外)。

圖4 6組樣品OTUs的韋恩圖

對所有的樣品進行構(gòu)建稀釋性曲線(Rarefaction curve)，并利用香儂(Shannon)指數(shù)分析繪制曲線，結(jié)果分別見圖5和圖6。

圖5 樣品稀釋曲線

圖6 香儂指數(shù)曲線

從測序數(shù)目上看，樣品的稀釋曲線并未全部進入平臺期，但所有樣品香儂曲線最后均趨于平整，說明隨著測序數(shù)量的增加有可能會發(fā)現(xiàn)新的種屬，但此時樣品中細菌的多樣性不會變化，說明試驗所測的數(shù)據(jù)量足夠，能夠滿足試驗要求[13]。

由圖7可知，所有檢測的樣品在門水平上共有的主要優(yōu)勢菌為變形菌門[14](Proteobacteria)，為細菌域中最大的一門，其成員為革蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等病原菌。此外，放線菌門(Actionbacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在各個樣品中均有體現(xiàn)，其主要是來自土壤、人或動物腸道內(nèi)的細菌。

圖7 門水平上樣品間物種組成分析柱狀圖

由圖8可知，A組中主要的細菌為日本粳稻水稻屬(OryzasativaJaponicaGroupJapaneserice)約占18.34%、假單胞菌屬(Pseudomonas)約占7.89%和甲基桿菌屬(Methylobacterium)約占4.73%；經(jīng)烘烤后Mucilaginibacter、根瘤菌屬(Rhizobium)和假單胞菌屬占優(yōu)勢，分別約占10.83%，6.08%，5.42%；粉碎后日本粳稻水稻屬、短桿菌屬(Curtobacterium)和甲基桿菌屬分別以25.91%，13.50%，11.44%成為此工序中的主要細菌；混合、包裝和輻照滅菌中短桿菌屬均是相對含量最高的，其在混合時的相對含量為13.48%，經(jīng)包裝后上升至13.94%，而經(jīng)輻照處理后降低至11.26%，不僅是短桿菌屬，基本占主要的菌屬在經(jīng)輻照后均有一定幅度的減少，由此推斷，在混合到包裝的過程中可能會受到一些微生物的污染，輻照滅菌處理對細菌有一定的作用，但要更高程度地減少細菌，還應(yīng)在生產(chǎn)加工過程中的設(shè)備、接觸人員的清潔等方面多加注意。

圖8 屬水平上組間物種組成分析柱狀圖

對樣品的OTU組成進行PCA分析[15]，結(jié)果見圖9，其中C2、D、E、F樣品間距離較近，說明其物種組成更相似。圖10為NMDS分析圖，即非度量多維尺度法[16]。結(jié)合圖9和圖10可知，D、E、F和C組的樣品均位于A組的圈內(nèi)，說明這些組間的細菌種屬差異不明顯，產(chǎn)品中的主要微生物來自于原料，除了利用輻照處理對最終產(chǎn)品減少細菌外，還可以在現(xiàn)有工序基礎(chǔ)上加強原料清洗等。

圖9 OTU水平PCA分析圖

圖10 OTU水平NMDS分析圖

2.5 ITS1真菌菌群分析

由表2可知，原料A組和烘烤B組的OTU數(shù)差別較大，均有大幅度減少，可能是因為某些真菌對烘烤的高溫環(huán)境不耐受，從而對原料起到一定減少或殺滅微生物的作用，是控制產(chǎn)品微生物的重要步驟。

表2 單個樣本的真菌菌群OTU數(shù)目統(tǒng)計

由圖12可知，5組樣品中共有的OTU數(shù)是21個，明顯不同于細菌高達184個相同數(shù)，共有的OTU數(shù)量少，推測每個加工環(huán)節(jié)會在一定程度上帶來一些不是原料中所帶有的真菌。

由圖12和圖13可知，從測序數(shù)目上看，樣品的稀釋曲線并未全部進入平臺期，但所有樣品的香儂曲線最后均趨于平整，說明隨著測序數(shù)量的增加可能會發(fā)現(xiàn)新的種屬，但此時樣品中細菌的多樣性不再變化，說明試驗所測的數(shù)據(jù)量足夠，滿足試驗要求。

圖11 6組樣品OTUs的韋恩圖

圖12 樣品稀釋曲線

圖13 香儂指數(shù)曲線

由圖14可知，所檢測的樣品在門水平上的主要優(yōu)勢菌有擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)，為真菌中的高等真菌，擔(dān)子菌門是構(gòu)成蘑菇、木耳等主要食用菌的菌種，子囊菌門是真菌中最大的類群，與其他真菌不同的是會產(chǎn)生子囊。門水平上能夠得到的真菌物種信息較少，還需對其進行更深的探究。

圖14 門水平上樣品間物種組成分析柱狀圖

由圖15可知，除去未確認的，A組中主要的真菌為木耳屬(Auricularia)約占18.29%和附球菌屬(Epicoccum)約占15.95%，木耳菌屬來自于原料中的黑木耳，附球菌屬主要參在土壤中，與植物原料的來源相符；烘烤后，占最主要的真菌為木耳菌屬，來自于原料中的黑木耳，其他菌屬占比不足1%，由此推測，原料中帶有的真菌，大部分對烘烤的高溫環(huán)境并不耐受，烘烤可減少大部分的真菌，是控制產(chǎn)品中真菌的重要工序。

圖15 屬水平上組間物種組成分析柱狀圖

由圖16可知，A4在真菌物種組成上與D、E、F的樣品間距離較近，說明其物種組成更相似，與2.4的結(jié)果相同。由圖16和圖17可知，產(chǎn)品中的主要真菌來源于黑木耳，經(jīng)烘烤后，只有木耳菌屬為主要菌屬，說明烘烤對產(chǎn)品最終真菌數(shù)量的控制有一定效果。

圖16 OTU水平PCA分析

圖17 OTU水平NMDS分析

3 結(jié)論

通過對黑色沖調(diào)粉的實際加工過程中車間空氣、設(shè)備、材料進行菌落總數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)車間設(shè)備、空氣及人員均會對產(chǎn)品中微生物含量有所影響，通過對加工關(guān)鍵點取樣進行測序分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品中的短接桿菌屬相對含量較高，經(jīng)輻照后能夠減少至11.26%，烘烤對細菌的影響較小，輻照對細菌的減少也有一定效果；分析真菌上屬水平的物種發(fā)現(xiàn)，原料中大部分的真菌對高溫環(huán)境敏感，產(chǎn)品中相對含量最高的是木耳菌屬約占97.99%，說明烘烤可以有效減少真菌數(shù)量。因此，若要更進一步減少產(chǎn)品中細菌和真菌數(shù)量，還需對車間定時進行通風(fēng)換氣、清潔地面，設(shè)備按時全面清潔，對工人手皮膚表面要多次有效清潔來控制產(chǎn)品加工過程中的微生物。后續(xù)將進一步分析黑色沖調(diào)粉對人體的消化特性和對腸道微生物的影響。