miR-16-5p對(duì)食管鱗癌的診斷價(jià)值和作用機(jī)制研究

馮巧燕 張波 張健 徐建峰

食管癌是世界第七大常見(jiàn)的癌癥，其中食管鱗狀細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱食管鱗癌）約占90%[1]。由于其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者初次診斷時(shí)已經(jīng)處于疾病晚期。早期食管癌患者的術(shù)后5年生存率為80%～90%，而晚期患者僅為25%[2]。由此可見(jiàn)，食管癌的早期診斷至關(guān)重要?；铙w組織病理檢查是癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但這種診斷方法不方便且具有侵入性。因此，尋找合適的生物標(biāo)志物輔助腫瘤早期診斷意義重大。microRNA（miRNA）是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)降解靶mRNA或阻斷其翻譯從而調(diào)控基因表達(dá)[3]。研究表明，特定miRNA的表達(dá)異常對(duì)腫瘤增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用[4-5]。不同類(lèi)型腫瘤的miRNA表達(dá)譜不盡相同，這種情況不僅存在于患者腫瘤組織內(nèi)，患者的血液、唾液等miRNA表達(dá)水平也可能發(fā)生改變[6-7]。因此，檢測(cè)特定miRNA是否發(fā)生改變可能對(duì)食管癌診斷具有一定的指導(dǎo)作用?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)基因表達(dá)匯編（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)探尋食管鱗癌患者和健康人群血清中差異表達(dá)的miRNA；通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)浙江省臺(tái)州醫(yī)院的35例食管鱗癌患者的血清與健康人群血清中的miR-16-5p進(jìn)行檢測(cè)和分析，并通過(guò)ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-16-5p作為食管鱗癌生物標(biāo)志物的潛在可能；下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)分析miR-16-5p在食管鱗癌組織中的表達(dá)，初步分析其作用機(jī)制，以期為miR-16-5p成為食管鱗癌生物標(biāo)志物提供理論支持，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 采集浙江省臺(tái)州醫(yī)院2015年9月至2019年6月收治的病理學(xué)檢查確診為食管鱗癌的35例患者的血液標(biāo)本和35例健康體檢者的血液標(biāo)本，標(biāo)本均由中心實(shí)驗(yàn)室規(guī)范保存。35例食管鱗癌患者中男27例，女8例；年齡＜60歲22例，≥60歲13例；腫瘤位于食管中段～中上段13例，中下段～下段22例；N0或Nx期21例，N1～2期14例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 GEO數(shù)據(jù)篩選 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載 GSE71043數(shù)據(jù)集，共3例食管鱗癌患者血清和3例健康人血清的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)納入本研究。通過(guò)GEO2R工具篩選食管鱗癌患者血清與健康人群血清中的差異表達(dá)miRNA。

1.2.2 血清miR-16-5p表達(dá)水平檢測(cè) 受試者采用普通生化管抽取5 ml靜脈血，在常溫下3 000 r/min離心10 min（離心半徑16 cm）獲得血清標(biāo)本，使用TRIzol試劑（美國(guó)賽默飛公司）提取血清標(biāo)本中的總RNA。根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)賽默飛公司）制備cDNA。采用PCR試劑（上海吉瑪公司）配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以cel-miR-39為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化，使用 2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。miR-16-5p的上游引物：5'-GATCTTGAAGGGGACCGCAATGGA-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。cel-miR-39的上游引物：5'-CACTCCGTCACCGGGTGTAAATC-3'，下游引物：5'-TCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物由上海生工生物有限公司（上海生工）合成。

1.2.3 TCGA數(shù)據(jù)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cancergenome.nih.gov/）中下載食管鱗癌高通量基因測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，共95例食管鱗癌組織和13例癌旁正常組織的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)納入本研究。所有miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)采用log2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.4 京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體論（gene ontology，GO）富集分析 從miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirtarbase.cuhk.edu.cn）下載miR-16-5p的靶基因。將靶基因上傳至用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行 EKGG 和GO功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者血清與健康人群血清miR-16-5p表達(dá)水平比較 GEO數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)分析結(jié)果和qRTPCR檢測(cè)結(jié)果均顯示食管鱗癌患者血清miR-16-5p表達(dá)水平明顯高于健康人群血清，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 食管鱗癌患者血清與健康人群血清miR-16-5p表達(dá)水平比較

2.2 miR-16-5p對(duì)食管鱗癌的診斷效能分析 利用Younden指數(shù)的ROC曲線得到能區(qū)分食管鱗癌患者與健康人群的截?cái)嘀?。miR-16-5p的靈敏度為0.7143，特異度為0.8857，此時(shí)最佳截?cái)嘀禐?.3351，AUC為0.802（95%CI:0.689～0.887），見(jiàn)圖 1。

圖1 miR-16-5p診斷食管鱗癌組織的ROC曲線

2.3 不同臨床特征食管鱗癌患者血清miR-16-5p表達(dá)水平比較 35例食管鱗癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清中miR-16-5p表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移未知患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但不同性別、年齡、吸煙史、飲酒史和腫瘤位置患者血清中miR-16-5p表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 不同臨床特征食管鱗癌患者血清miR-16-5p表達(dá)水平比較

2.4 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-16-5p表達(dá)水平比較 TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示食管鱗癌患者癌組織 miR-16-5p表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-16-5p表達(dá)水平比較

2.5 miR-16-5p在食管鱗癌中的作用機(jī)制GO和KEGG富集分析結(jié)果 從miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲取已經(jīng)證實(shí)的1 557個(gè)miR-16-5p的靶基因，對(duì)這些靶基因進(jìn)行富集功能富集分析。KEGG富集結(jié)果顯示，miR-16-5p的靶基因顯著富集于PI3K-Akt、p53、Hippo等多條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路（P＜0.05），見(jiàn)表4。GO富集結(jié)果顯示，miR-16-5p的靶基因顯著富集于翻譯、結(jié)合蛋白、細(xì)胞黏附等（P＜0.05），見(jiàn)表 5。

表4 miR-16-5p靶基因的KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果

表5 miR-16-5p靶基因的GO富集結(jié)果

3 討論

目前，食管癌仍是當(dāng)今世界最具致命性的癌癥之一。盡管預(yù)防與治療食管癌的方法和手段有所改進(jìn)，但對(duì)于中晚期食管癌，這些干預(yù)性措施療效有限。尋找新型的診斷方法和合適的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。本研究探討了miR-16-5p在食管鱗癌患者血清和癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，血清中miR-16-5p或可作為篩查食管鱗癌患者的生物標(biāo)志物。與健康人群血清相比，食管鱗癌患者血清中的miR-16-5p水平顯著上調(diào)，這一結(jié)論得到GEO數(shù)據(jù)分析結(jié)果的支持。ROC曲線分析結(jié)果顯示血清中miR-16-5p檢測(cè)食管鱗癌患者的AUC值為0.802，具備較高的靈敏度和特異度。同時(shí)，本研究還顯示血清中miR-16-5p的表達(dá)與食管鱗癌進(jìn)展有關(guān)，食管鱗癌患者血清中miR-16-5p的表達(dá)水平在有淋巴轉(zhuǎn)移的患者中明顯上調(diào)，但這需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。另外，本研究顯示食管鱗癌組織中miR-16-5p的表達(dá)水平顯著上調(diào)，這表明miR-16-5p參與食管鱗癌的發(fā)生。KEGG和GO功能富集分析表明miR-16-5p可能通過(guò)調(diào)控翻譯、結(jié)合蛋白、細(xì)胞黏附從而影響食管鱗癌的發(fā)生與發(fā)展，多條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路或參與該過(guò)程。

一系列研究已經(jīng)證明循環(huán)miRNA在各種癌癥中的診斷價(jià)值。在眾多的miRNA中，miR-16-5p是最具代表性的miRNA之一。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)miR-16-5p在非小細(xì)胞癌、肝癌、胃癌等腫瘤患者血清中均有顯著變化。Fan等[8]的研究顯示miR-16-5p診斷非小細(xì)胞肺癌的靈敏度為0.88，特異度為0.86；Qu等[9]發(fā)現(xiàn)miR-16-5p診斷肝癌的靈敏度為0.721，特異度為0.888；而在Wang等[10]的研究中，miR-16-5p診斷胃癌的靈敏度為0.79，特異度為0.78。上述研究表明，miR-16-5p或可作為某些特點(diǎn)腫瘤診斷的潛在生物標(biāo)志物。近些年的研究已經(jīng)證實(shí)miR-16-5p在食管鱗癌患者血清中表達(dá)上調(diào)[11-12]，這與本研究結(jié)論一致。

另一方面，大量研究發(fā)現(xiàn)miR-16-5p在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[13-15]。Qu等[13]的研究顯示miR-16-5p通過(guò)靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Cheng等[14]發(fā)現(xiàn)miR-16-5p可通過(guò)直接靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）蛋白表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。在結(jié)直腸癌，Wu等[15]發(fā)現(xiàn)miR-16-5p通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1/蛋白激酶B（VEGFA/VEGFR1/Akt軸起抑癌作用。上述研究表明miR-16-5p是多種腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵因子。

綜上所述，miR-16-5p在食管鱗癌患者血清和癌組織中均顯著上調(diào)，或可作為食管鱗癌輔助診斷的生物標(biāo)志物。miR-16-5p可能通過(guò)調(diào)控翻譯、結(jié)合蛋白、細(xì)胞黏附從而影響食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，多條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路或參與該過(guò)程。