肉蓯蓉多糖對UVB誘導(dǎo)皮膚急性光損傷的保護(hù)作用

劉園園趙心明楊珍李雪郭若曦

(1.天津城市職業(yè)學(xué)院，天津 300250；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；4.天津尚美化妝品有限公司，天津 300385)

皮膚是人體最外層組織，具有屏障作用，可以抵御包括紫外線在內(nèi)的外部不良因素對人體的損傷。人體適量接受紫外線的照射有助于人體健康，但急性過量紫外線照射可損傷皮膚及皮膚屏障，出現(xiàn)紅斑、水腫、水皰、炎癥性疼痛等急性光損傷表現(xiàn)[1]。隨著人們對皮膚老化研究逐漸深入，越來越多的學(xué)者關(guān)注UVB引起的皮膚急性光損傷，而對于該病的防治許多具有生物學(xué)活性的植物提取物已被報道[2-4]。

肉蓯蓉是我國的傳統(tǒng)藥食兩用的藥物，被列為九大仙草之一，素有“沙漠人參”的美譽(yù)[5]。主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類、多糖等，具有廣泛的生物活性[6]。其中肉蓯蓉多糖具有調(diào)節(jié)免疫活性、抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶能力、保護(hù)神經(jīng)、抗肝損傷、抗病毒、抗腫瘤、影響腸道菌群等諸多藥理作用[7]。但未見其對UVB引起的皮膚急性光損傷的保護(hù)研究。故本研究將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，研究肉蓯蓉多糖對皮膚急性光損傷的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，4%組織固定液(北京索萊寶科技有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：BC0175)，丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：BC0025)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：M1020),二甲基亞砜DMSO(北京索萊寶科技有限公司，貨號：D8371)。肉蓯蓉經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為管花肉蓯蓉(Cistanche tubulosa)。

電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)，SH4型紫外線光療儀(上海希格瑪高技術(shù)有限公司)，MULTISKAN GO酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)，皮膚水分含量測試儀(德國CK公司)，BDS200型倒置光學(xué)生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器公司)。

ICR小鼠，體質(zhì)量18～22g，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK(京)2019-0010。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉蓯蓉多糖的制備[8]

取40g肉蓯蓉粗粉，用120mL 95%的乙醇回流提取2h，去除色素和脂溶性雜質(zhì)，取濾渣揮干溶劑后，加入15倍量的水，95℃水浴提取2次，每次3h，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至濃度分別為80mg·mL-1和320mg·mL-1，4℃保存，備用。

1.2.2 肉蓯蓉多糖對HaCaT細(xì)胞存活率的影響[9]

實(shí)驗(yàn)分為對照組、UVB組和肉蓯蓉多糖加UVB組，將HaCaT細(xì)胞接種于96孔板，貼壁后，正常組不進(jìn)行處理，模型組、肉蓯蓉多糖加UVB組均分別以30mJ·cm-2和60mJ·cm-2的UVB進(jìn)行照射，照射完畢后，給藥組分別給予20mg·mL-1、50mg·mL-1、80mg·mL-1的肉蓯蓉多糖，培養(yǎng)24h，棄去上清液，用PBS清洗一遍，每孔加入100μL含有10%MTT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入100μL DMSO溶液，放入酶標(biāo)儀振搖1min，使結(jié)晶物充分溶解，在492nm處測定各孔的吸光度，記錄結(jié)果。

式中，AOD值為對照組對應(yīng)的OD值；BOD值為UVB組、肉蓯蓉多糖加UVB組對應(yīng)的OD值。

1.2.3 急性光損傷模型的建立及用藥[10]

ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，按體重質(zhì)量隨機(jī)分為空白組，模型組，肉蓯蓉多糖高(320mg·mL-1)、低劑量組(80mg·mL-1)，每組6只。實(shí)驗(yàn)開始前，去除小鼠背部毛發(fā)(面積約為3cm×3cm)。取0.25mL肉蓯蓉多糖均勻涂抹于小鼠背部脫毛區(qū)域，空白組和模型組以等體積的生理鹽水涂抹，30min后用300mJ·cm-2的UVB照射背部脫毛區(qū)域，連續(xù)照射3d，于最后一天照射結(jié)束后，活體情況下測定小鼠皮膚含水量，處死小鼠，分別取血液和脫毛部的皮膚組織，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 皮膚含水量測定[11]

在室溫為20～25℃，空氣相對濕度為50%～60%的環(huán)境下，使用皮膚水分含量測試儀對空白組，模型組，肉蓯蓉多糖高、低劑量組ICR小鼠進(jìn)行皮膚含水量測試，選取小鼠背部脫毛區(qū)域?qū)γ恐恍∈鬁y量3次，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。

1.2.5 HE染色

取約1cm2的皮膚組織固定于4%的組織固定液中，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.6 皮膚組織中SOD活性及MDA含量測定

取皮膚組織按試劑盒說明書檢測其中SOD活性及MDA含量。

1.2.7 血液中SOD活性及MDA含量測定

取小鼠血液于4℃冰箱靜置1h后，4℃3000rpm離心15min，取上清按試劑盒說明書檢測其中SOD活性及MDA含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用(Mean±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉蓯蓉多糖對UVB照射HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用

肉蓯蓉多糖對UVB照射HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用見圖1。與對照組比較，不同輻照劑量的UVB對HaCaT細(xì)胞均具有顯著的損傷作用(P<0.05)；與UVB(30mJ·cm-2、60mJ·cm-2)組相比，濃度為20mg·mL-1和50mg·mL-1肉蓯蓉多糖，對不同輻照劑量UVB照射導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用(P<0.05)，而濃度為80mg·mL-1肉蓯蓉多糖，對不同輻照劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用則沒有顯著性。

2.2 皮膚含水量變化

肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠皮膚含水量的影響結(jié)果見表1。模型組ICR小鼠皮膚含水量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，肉蓯蓉多糖高、低劑量組可以顯著提高小鼠皮膚含水量(P<0.05)，肉蓯蓉多糖高劑量組ICR小鼠皮膚含水量與空白組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表1 肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠皮膚皮膚含水量的影響(x±s，n=3)

2.3 組織切片HE染色結(jié)果

肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠皮膚組織的病理學(xué)影響結(jié)果見圖2?？瞻捉M小鼠表皮層結(jié)構(gòu)完整，有2～3層角質(zhì)形成細(xì)胞，細(xì)胞分層清晰；真皮層可見波浪狀纖維組織，排列有序，分布均勻，疏密有致，細(xì)胞成分及數(shù)量適中。與空白組相比，模型組小鼠表皮海綿水腫明顯，個別細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞分層不清；以淋巴細(xì)胞為主的單一核炎性細(xì)胞高度浸潤，毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，表明急性光損傷模型造模成功。給藥組小鼠表皮皮膚因光損傷所致組織病理改變程度較模型組減輕，表皮局灶性海綿水腫和炎癥有所緩解，但尚未恢復(fù)到正常表皮狀態(tài)。

圖2 肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠皮膚組織的病理學(xué)影響(HE×200)

2.4 皮膚組織中SOD活性及MDA含量變化

肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠皮膚組織中SOD活性和MDA含量的影響結(jié)果見表2。與空白組相比，模型組ICR小鼠皮膚組織中SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，肉蓯蓉多糖高、低劑量組的SOD活性顯著增加(P<0.05)，表明肉蓯蓉多糖可有效抑制氧自由基的連續(xù)反應(yīng)發(fā)生，提高皮膚組織的自御能力。與模型組相比，肉蓯蓉多糖高、低劑量組的MDA含量有降低趨勢(P>0.05)。

表2 肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠皮膚組織中SOD活性和MDA含量的影響(x±s，n=3)

2.5 血液中SOD活性及MDA含量變化

肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠血液中SOD活性和MDA含量的影響結(jié)果見表3。與空白組相比，模型組ICR小鼠血液中SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，經(jīng)肉蓯蓉多糖干預(yù)后，急性光損傷ICR小鼠血液中SOD活性有升高趨勢(P>0.05)，MDA含量有降低趨勢(P>0.05)。

表3 肉蓯蓉多糖對急性光損傷小鼠血液中SOD活性和MDA含量的影響(ˉx±s，n=3)

3 討論

肉蓯蓉是藥食兩用的藥物，其中肉蓯蓉多糖是肉蓯蓉的主要生物功能活性成分之一，本研究發(fā)現(xiàn)，UVB對HaCaT細(xì)胞具有損傷作用肉蓯蓉多糖(20mg·mL-1、50mg·mL-1)對該損傷具有保護(hù)作用，而80mg·mL-1的肉蓯蓉多糖對UVB照射的HaCaT細(xì)胞的存活率則沒有保護(hù)作用，可能因?yàn)樗幬餄舛冗^高，產(chǎn)生了一定的細(xì)胞毒性；肉蓯蓉多糖可以顯著提高皮膚組織中的SOD含量，說明肉蓯蓉多糖具有清除ROS的作用，與其體外作用相一致[8]。而血液中SOD含量與模型組相比僅有上升趨勢，是由于肉蓯蓉多糖為水溶性成分，透皮吸收量不高，不能顯著提高血液中SOD含量。對于靶部位在皮膚組織的疾病而言，能夠提高皮膚組織中的SOD含量對疾病的治療具有一定的意義；肉蓯蓉多糖高劑量組皮膚含水幾乎和正常組相當(dāng)，除了肉蓯蓉多糖具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可以中和掉由UVB產(chǎn)生的自由基[8]，還可能是由于多糖本身具有一定的吸濕性[12]，可以維持皮膚一定的含水量；該研究中存在的不足主要是動物實(shí)驗(yàn)中UVB照射動物過程中，因UVB光線是漫反射和小鼠較難固定易移動，會導(dǎo)致不同位置的動物背部接收的紫外劑量不一致，會影響到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。