Aspirin乙?；疕DAC2抑制腫瘤細(xì)胞增殖

戚 倩,余 巍

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

乙?；揎検且环N極其重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，高度保守且可逆，能夠調(diào)控體內(nèi)諸多蛋白的功能，如代謝酶、組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等[1-2].乙酰化修飾最早發(fā)現(xiàn)存在于組蛋白，隨著研究的深入，大量非組蛋白的乙?；揎棻话l(fā)現(xiàn)且廣泛分布于各個(gè)亞細(xì)胞器中.乙?；ㄟ^(guò)影響蛋白活性、定位、穩(wěn)定性及蛋白相互作用等參與調(diào)控細(xì)胞的代謝、衰老、凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等幾乎所有的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程.乙?；D(zhuǎn)移酶和去乙?；腹餐{(diào)節(jié)乙?；腿ヒ阴；膭?dòng)態(tài)平衡，乙酰化調(diào)控的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3].很多研究揭示了去乙酰化酶在腫瘤中的異常表達(dá)和活性.去乙?；敢惨虼顺蔀榫哂星熬暗目拱┧幬锇悬c(diǎn)，我國(guó)自主研發(fā)的組蛋白去乙?；敢种苿?Histone Deacetylase Inhibitors, HDACIs)西達(dá)苯胺是第一個(gè)被美國(guó)FDA授權(quán)專利使用的新型抗腫瘤藥物.HDACIs可通過(guò)調(diào)節(jié)異常增生和凋亡基因的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[4].HDACs在多種癌癥中高表達(dá)，如HDAC1在胃癌中高表達(dá)[5-6]，HDAC2和HDAC3在結(jié)腸癌中高表達(dá)[7-8].更有表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1和HDAC2這兩種亞型與腫瘤的發(fā)生發(fā)展尤為相關(guān)[9].HDAC2是Ⅰ類組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HDAC2)，廣泛分布于細(xì)胞核中，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化.有研究結(jié)果表明，HDAC2在腫瘤組織中異常表達(dá)，敲除HDAC2使某些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯甚至凋亡[10].因此特異性的抑制HDAC2，將為癌癥的防治提供新的思路.

Aspirin又稱乙酰水楊酸，是一種經(jīng)典的非甾體抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs)，最早用于解熱鎮(zhèn)痛，后發(fā)現(xiàn)還具有抗血小板的作用而被廣泛用于預(yù)防心血管疾病.近年來(lái)，大量的流行病學(xué)和臨床研究證據(jù)表明，Aspirin還具有抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，降低多種惡性腫瘤的發(fā)病率、轉(zhuǎn)移率及癌癥的死亡率，在消化道腫瘤中尤為明顯[11-13].Aspirin也可以和其他藥物聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮抗腫瘤作用，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療的敏感性.

Aspirin的抗腫瘤機(jī)制尚不完全明確，目前認(rèn)為主要通過(guò)環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase, COX)途徑和非環(huán)氧化酶途徑來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展.Aspirin可以對(duì)蛋白、激素、核酸等多種底物進(jìn)行乙?；揎梉14-15]，研究Aspirin的底物及功能對(duì)理解其抗腫瘤機(jī)制有重要意義.明確Aspirin抗腫瘤作用的分子靶點(diǎn)及其機(jī)制，也將對(duì)臨床治療起到指導(dǎo)作用.本研究發(fā)現(xiàn)Aspirin能夠直接乙?；疕DAC2并抑制其去乙?；钚?，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并進(jìn)一步鑒定到K51位為乙?；揎椀年P(guān)鍵位點(diǎn).同時(shí)，作為去乙?；?HDAC2能夠發(fā)生自身去乙?；?本研究初步揭示了Aspirin發(fā)揮抗腫瘤作用的一種新機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料及相關(guān)試劑

HEK293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116來(lái)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，HA抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，F(xiàn)LAG抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，HDAC1、HDAC2、Acetylated-Lysine抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司，GAPDH抗體購(gòu)自Beyotime公司.Flag磁珠購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司.KOD-plus定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自日本東洋紡公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生物科技公司.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞、HCT116細(xì)胞均使用DMEM高糖培養(yǎng)基，并向其中加入10%的胎牛血清，放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

采用PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn).當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染(10 cm培養(yǎng)皿)，于1.5 mL的EP管中依次加入1 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基、4 μg目的質(zhì)粒和12 μL的PEI(1 μg/μL)試劑(即DNA∶PEI=1∶3)，混合均勻后，靜置15 min，滴加到待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)皿中.8～12 h后更換培養(yǎng)基，36～48 h后收樣處理.

1.3 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, CO-IP)

除去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗去殘留液，加入1 mL裂解液(如NP-40，使用前加入蛋白酶抑制劑)，于4 ℃水平搖床快速裂解25 min.將裂解液收集到1.5 mL的EP管中，4 ℃，13 000 r/min，離心30 min，取上清棄沉淀.分別取20 μL上清與5 μL的5×SDS上樣緩沖液混勻，95 ℃變性10 min，留作Input待用.向剩余的上清液加入10 μL偶聯(lián)有抗體的beads濁液，4 ℃旋轉(zhuǎn)4 h或過(guò)夜.4 ℃，3 000 r/min，離心2 min，加入1 mL裂解液，重復(fù)清洗3次.除去上清，加入適量的1×SDS上樣緩沖液，95 ℃煮樣15 min，待用.

1.4 免疫印跡(Western blot)

通常配制上層膠濃縮濃度為5%，下層分離膠濃度為10%或12%的SDS-PAGE凝膠用于Western blot實(shí)驗(yàn).加入電泳緩沖液后上樣，80 V恒壓30 min，調(diào)至120 V，直到溴酚藍(lán)指示恰好跑出凝膠，電泳結(jié)束.300 mA恒流濕轉(zhuǎn)70 min，取出NC膜，于封閉液(5% BSA)中室溫封閉1 h.一抗室溫低速水平搖床孵育1 h或4 ℃過(guò)夜.加入TBST洗膜3次，每次5 min.根據(jù)一抗加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(抗鼠或兔的IgG)，室溫孵育1 h.洗膜3次，顯影記錄.

1.5 蛋白純化

在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)含F(xiàn)lag標(biāo)簽的目的蛋白，利用Flag-beads進(jìn)行免疫沉淀，加入5倍beads體積的3×Flag peptide，4 ℃旋轉(zhuǎn)洗脫30 min，離心收集上清，分裝，-80 ℃凍存.

1.6 HDAC2酶活檢測(cè)

以MAL[Boc-Lys(AC)amc]為底物，將真核純化的野生型HDAC2及其突變體分別加入酶活反應(yīng)液中混勻，37 ℃避光反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)添加胰蛋白酶(5 mg/mL)終止反應(yīng)，檢測(cè)F360/F460的熒光強(qiáng)度.去乙?；磻?yīng)液:Tris-HCl 50 mmol/L、MgCl24 mmol/L、DTT 0.2 mmol/L、pH=9.0.

1.7 質(zhì)譜分析

利用同位素D標(biāo)記的Aspirin處理過(guò)表達(dá)Flag-HDAC2的HEK293T細(xì)胞，利用Flag-beads進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)制取樣品，交由復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)質(zhì)譜中心進(jìn)行乙酰化譜的質(zhì)譜分析.

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用Graphpad Prism軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析.所有數(shù)據(jù)處理都遵循SEM分析法(mean±SD).P<0.05則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義即有明顯差異，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.000 1.

1.9 慢病毒包裝

本實(shí)驗(yàn)中的shHDAC2的靶向序列來(lái)源于Sigma.序列設(shè)計(jì)如下: shHDAC2#1(5’-CCGGCAGTCT CACCAATTTCAGAAACTCGAGTTTCTGAAATTGGTGAGACTGTTTTTG-3’)；shHDAC2#2(5’-CCGGGCAAATACTATGCTGTCAATTCTCGAGAATTGACAGCATAGTATTTGCTTTTTG-3’).

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞，利用PEI試劑轉(zhuǎn)染表達(dá)shRNA的慢病毒載體質(zhì)粒1 μg pLKO.1及包裝質(zhì)粒750 ng psPAX2和250 ng pMD2.G(4∶3∶1)，8 h后換液，48 h后收集病毒上清，離心凍存于-80 ℃.感染時(shí)，將病毒上清與新鮮培養(yǎng)基以3∶1的比例添加，同時(shí)添加polybrene至終濃度8 μg/mL，最后將待感染的細(xì)胞懸液均勻加入.

1.10 HDAC2體外去乙?；瘜?shí)驗(yàn)

通過(guò)真核純化得到Flag-HDAC2和HA-HDAC2蛋白，以HA-HDAC2為底物加入Aspirin共孵育，使其發(fā)生乙?；揎?，達(dá)到HA-HDAC2(ac)狀態(tài)，洗去多余Aspirin.后加入Flag-HDAC2置于37 ℃條件下進(jìn)行去乙酰化反應(yīng).

1.11 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8試劑盒，消化狀態(tài)良好的不同細(xì)胞系，重懸制成單細(xì)胞懸液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，配成1 000個(gè)/100 μL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL鋪于96孔板，確認(rèn)細(xì)胞貼壁后，每隔24 h每孔加入10 μL CCK-8，反應(yīng)1 h后，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)OD值.

2 結(jié) 果

2.1 Aspirin為HDAC2的乙?；峁┮阴；?/h3>

首先，我們通過(guò)免疫沉淀得到真核純化的HDAC2-HA蛋白.將不同濃度的Aspirin與HDAC2在體外共孵育，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aspirin能夠?yàn)镠DAC2-HA提供乙?；蛊湟阴；?，且乙酰化程度隨Aspirin的濃度梯度的提高而提高(圖1(a，c)).為進(jìn)一步證實(shí)Aspirin能夠在細(xì)胞內(nèi)為HDAC2提供乙酰基，我們用Aspirin處理過(guò)表達(dá)Flag-HDAC2的HEK293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Flag-HDAC2的乙?；潭纫搽S著Aspirin的濃度梯度的提高而提高(圖1(b，d)).綜上所述，Aspirin可以為HDAC2的乙酰化提供乙?；乙阴；潭扰c濃度呈正相關(guān).

圖1 Aspirin乙?；疕DAC2Fig.1 HDAC2 can be acetylated by Aspirin(a) 體外條件下Aspirin能夠乙酰化HDAC2蛋白;(b) Aspirin能夠乙?；?xì)胞內(nèi)的HDAC2;(c),(d)分別為(a),(b)圖中乙?；潭鹊慕y(tǒng)計(jì)分析，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個(gè)樣本3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，Asp1,Asp2,Asp4分別指1，2，4 mmol/L Aspirin. TSA0.5指的是0.5 μmol/LTSA.

2.2 乙?；种艸DAC2的去乙?；钚?/h3>

HDAC2作為一個(gè)重要的去乙?；?，Aspirin乙酰化修飾HDAC2是否會(huì)對(duì)其去乙?；钚援a(chǎn)生影響.通過(guò)免疫沉淀得到真核純化的Flag-HDAC2蛋白，將蛋白與Aspirin體外共孵育，根據(jù)以MAL[Boc-Lys(AC)amc]為底物的酶活檢測(cè)體系檢測(cè)HDAC2的去乙?；钚?結(jié)果如圖2(a)所示，隨著Aspirin濃度的增加，HDAC2的去乙?；钚灾饾u降低;此外，我們從Aspirin處理后的細(xì)胞中真核純化已帶有乙?；揎椀腇lag-HDAC2(ac)蛋白，將其用于酶活檢測(cè).結(jié)果如圖2(b)所示，Aspirin處理后，細(xì)胞內(nèi)HDAC2的去乙?；钚越档?因此，無(wú)論是體外共孵育(圖2(a))還是直接處理細(xì)胞(圖2(b))，Aspirin都顯著降低了HDAC2的去乙酰化活性，這表明乙?；揎棔?huì)抑制HDAC2的去乙?；钚?

圖2 Aspirin抑制HDAC2的去乙酰化活性Fig.2 Aspirin inhibits the deacetylation activity of HDAC2(a) 體外條件下Aspirin與HDAC2共孵育，Aspirin抑制HDAC2的去乙?；钚?，圖中HDAC2去乙?；钚缘慕y(tǒng)計(jì)分析，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個(gè)樣本3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn);(b) Aspirin處理HEK293T細(xì)胞，乙酰化的HDAC2酶活降低，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個(gè)樣本3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)(Two-tailed t-test: *P<0.05，***P<0.001).Asp1,Asp2,Asp4分別指1，2，4 mmol/L Aspirin. TSA0.5指的是0.5 μmol/LTSA.

2.3 K51是HDAC2乙?；揎椀年P(guān)鍵位點(diǎn)

利用同位素氘D(2H)標(biāo)記乙?；腁spirin處理過(guò)表達(dá)Flag-HDAC2的HEK293T細(xì)胞，將免疫沉淀得到的樣品進(jìn)行乙?；V的質(zhì)譜分析，我們鑒定到HDAC2發(fā)生Aspirin乙?；揎椀馁嚢彼?K)位點(diǎn)為K243、K51、K280、K362、K59、K284、K90、K67、K32、K75、K219、K221(圖3(a)).對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析顯示，細(xì)胞中約有30%的HDAC2的賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生的乙?；揎梺?lái)自Aspirin的乙?；?圖3(b)).

圖3 質(zhì)譜鑒定到的HDAC2的乙?；稽c(diǎn)Fig.3 The acetylation sites of HDAC2 detected by mass spectrographic analysis(a) 質(zhì)譜分析鑒定到的HDAC2中發(fā)生Aspirin乙?；揎椀碾亩渭拔稽c(diǎn);(b) HDAC2中發(fā)生Aspirin乙?；揎椀馁嚢彼嵛稽c(diǎn)所占比重.

為進(jìn)一步確定Aspirin介導(dǎo)HDAC2乙?；揎椀年P(guān)鍵位點(diǎn)，我們將質(zhì)譜鑒定到的賴氨酸(K)位點(diǎn)分別突變?yōu)楣劝滨０稱(模擬乙?；揎?和亮氨酸R(模擬去乙?；揎?，檢測(cè)突變型HDAC2的去乙酰化活性.實(shí)驗(yàn)表明，與野生型(WT)HDAC2蛋白相比，K51Q和K280Q突變型的去乙?；钚悦黠@下降，其他模擬乙?；蛔冃蚎無(wú)明顯差異(圖4(a，b)，見第630頁(yè))，這兩個(gè)位點(diǎn)在質(zhì)譜鑒定中的肽段峰圖如圖4(c,d)所示.

圖4 HDAC2K51Q和HDAC2K280Q的去乙酰化活性降低Fig.4 The deacetylation activity of HDAC2K51Q and HDAC2K280Q is reduced(a，b) 質(zhì)譜鑒定到的乙酰化位點(diǎn)的酶活檢測(cè)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個(gè)樣本3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)(Two-tailed t-test: ***P<0.001，****P<0.000 1);(c，d) K280、K51位點(diǎn)質(zhì)譜鑒定所在肽段峰圖.

隨后，利用NCBI檢索數(shù)據(jù)，將不同物種間的HDAC2進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HDCA2的K51位點(diǎn)保守性很高，而K280位點(diǎn)保守性較低(圖5(a))，故后續(xù)著重對(duì)K51位點(diǎn)進(jìn)行探究.進(jìn)一步檢測(cè)K51R的活性發(fā)現(xiàn)，其與野生型酶活也無(wú)明顯差異(圖5(b)).綜合以上幾點(diǎn)，HDAC2 K51位點(diǎn)是Aspirin介導(dǎo)的乙?；揎椀年P(guān)鍵位點(diǎn)，該位點(diǎn)的乙?；揎椧种破渥陨砣ヒ阴；钚?

2.4 HDAC2可以發(fā)生自身去乙?；磻?yīng)

由于HDAC2是一種重要的去乙?；?，且Aspirin可以提供乙?；蛊浒l(fā)生乙酰化，那么HDAC2能否對(duì)其自身進(jìn)行去乙?；?我們利用免疫沉淀得到真核純化的Flag-HDAC2和HDAC2-HA蛋白.將HDAC2-HA蛋白與Aspirin共孵育，使其發(fā)生乙酰化修飾，轉(zhuǎn)變?yōu)镠DAC2(ac)-HA的狀態(tài)，后加入Flag-HDAC2蛋白進(jìn)行去乙?；磻?yīng).通過(guò)Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酰化修飾的HDAC2-HA，在與Flag-HDAC2共孵育后，HDAC2-HA的乙?；斤@著下降，而加入TSA(HDACIs)則可抑制Flag-HDAC2對(duì)HDAC2-HA的去乙?；?圖6).因此，HDAC2可以發(fā)生自身去乙酰化反應(yīng).

2.5 HDAC2乙?；揎椧种颇[瘤細(xì)胞增殖

有報(bào)道Aspirin可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且HDACIs也可通過(guò)抑制HDACs的活性抑制腫瘤細(xì)胞增殖.因此，我們?cè)诮Y(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系HCT116中構(gòu)建了HDAC2敲低的穩(wěn)定細(xì)胞系(圖7(a))，檢測(cè)Aspirin處理對(duì)于敲低HDAC2前后腫瘤細(xì)胞增殖的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖7(c))，Aspirin處理可以抑制HCT116的增殖;而對(duì)于敲低HDAC2后的HCT116細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用.

綜上，我們初步證明了Aspirin可以抑制HCT116細(xì)胞的增殖且該抑制作用可能與HDAC2有關(guān).為進(jìn)一步驗(yàn)證Aspirin通過(guò)抑制HDAC2的活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，我們?cè)贖DAC2敲低的細(xì)胞系中分別回補(bǔ)了野生型HDAC2-WT和HDAC2-K51Q突變型(圖7(b))，并檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知(圖7(c))，回補(bǔ)HDAC2-WT，而非模擬乙?；腍DAC2-K51Q，可以逆轉(zhuǎn)Aspirin對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用.結(jié)果表明，Aspirin可能是通過(guò)抑制HDAC2發(fā)揮抗腫瘤作用.

3 討 論

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)除了經(jīng)典的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用外，Aspirin還具有抗腫瘤作用，且安全性高于其他抗腫瘤藥物，故Aspirin在抗腫瘤方面的應(yīng)用引起廣泛關(guān)注.早在1988年，Kune等[16]就發(fā)現(xiàn)Aspirin除原有的藥理作用外，還能夠降低患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn).在隨后的研究中，研究人員又發(fā)現(xiàn)Aspirin的抗腫瘤作用并不僅僅局限于結(jié)直腸癌中，其在肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢腺癌和肺癌等多種癌癥中都表現(xiàn)出抗腫瘤作用[17-20].更有流行病學(xué)研究顯示，隨著Aspirin攝入量的增加，癌癥患者因腫瘤導(dǎo)致的死亡率呈指數(shù)型下降[21].

然而Aspirin抗腫瘤的機(jī)制目前還不完全明確，主要為環(huán)氧化酶(COX)途徑和非COX途徑.比較主流的觀點(diǎn)認(rèn)為其與Aspirin抑制COX的活性有關(guān).研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤組織中都存在環(huán)氧合酶-2(COX-2)的過(guò)表達(dá)[22-23].Aspirin可以下調(diào)COX-2的表達(dá)，介導(dǎo)COX-2催化的花生四烯酸(AA)途徑，阻斷前列腺素(PG)的生成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.Aspirin還可以通過(guò)抑制無(wú)核血小板中的COX-1導(dǎo)致血栓烷(TXA2)依賴性血小板功能的永久缺陷，從而降低血小板活化，阻礙癌癥的發(fā)展、轉(zhuǎn)移[24].此外，Aspirin還通過(guò)抑制NF-κB、Wnt/β-catenin、cAMP-PKA、PI3K/AKT/mTOR等信號(hào)通路，干擾ERK信號(hào)傳導(dǎo)，激活死亡受體(DR)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血小板聚集、增加線粒體膜的通透性，影響DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)等發(fā)揮抗腫瘤作用[25].當(dāng)前的諸多研究中，究竟是哪一種或哪幾種機(jī)制在抗腫瘤中起主導(dǎo)作用，尚存爭(zhēng)議.非COX途徑很可能是Aspirin抗腫瘤作用的基礎(chǔ)，其作用機(jī)制比較復(fù)雜，仍需進(jìn)一步的探討和研究.

乙酰化失調(diào)與癌癥等疾病有關(guān)，因而研究Aspirin的乙?；孜飳?duì)于闡明其抗腫瘤的機(jī)制有重要意義.在腫瘤細(xì)胞中，許多HDACs高度表達(dá)，導(dǎo)致去乙酰化作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)乙酰化水平失衡，抑制了某些抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26-27].越來(lái)越多的證據(jù)表明HDAC2在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，而敲除HDAC2則會(huì)引起某些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡.在人的早期結(jié)腸癌中，結(jié)腸息肉腫瘤抑制基因的丟失可以導(dǎo)致Wnt通路依賴性HDAC2表達(dá)增加.HDAC2調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)降解，β-catenin的降解可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[7].因此特異性地抑制HDAC2，將成為一種新的癌癥防治策略.在本研究中，我們首先通過(guò)體外和體內(nèi)乙?；瘜?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了Aspirin能夠直接提供乙?；笻DAC2乙?；页蕜┝肯嚓P(guān).由于去乙?；傅幕钚耘c癌癥發(fā)生密切相關(guān)[28-31]，故利用酶活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Aspirin對(duì)HDAC2去乙?；钚缘挠绊?我們的研究結(jié)果表明，Aspirin能夠抑制HDAC2的去乙酰化活性，且抑制程度隨濃度的增加而增強(qiáng).進(jìn)一步，通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定到了K51為影響HDAC2活性的關(guān)鍵乙?；揎椢稽c(diǎn).通過(guò)數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，K51位的保守性非常高，同時(shí)突變型HDAC2 K51Q蛋白相較于野生型HDAC2蛋白的去乙酰化活性顯著降低，表明K51位點(diǎn)可能是HDAC2酶活的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，暗示可以通過(guò)調(diào)控K51位點(diǎn)來(lái)影響HDAC2的去乙?；钚?HDACs抑制劑能夠抑制HDAC2的活性，維持正常的乙?；?，激活特定抑癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，有相當(dāng)高的臨床應(yīng)用價(jià)值.早在1990年，就有研究發(fā)現(xiàn)，HDACIs能夠抑制腫瘤細(xì)胞的存活[32-33].由此我們猜想HDAC2可能是Aspirin抑制腫瘤細(xì)胞增殖的底物.Aspirin通過(guò)提供乙酰基使HDAC2乙?；种破淙ヒ阴；钚詮亩M(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡達(dá)到抗腫瘤的目的.為了驗(yàn)證這一猜想，根據(jù)以上結(jié)果，我們利用Aspirin處理結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在Aspirin的作用下，HDAC2乙?；?，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制.但Aspirin對(duì)HDAC2敲低的HCT116細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，初步證明了Aspirin抑制HCT116細(xì)胞的增殖可能與HDAC2有關(guān).接下來(lái)又在HDAC2敲低的細(xì)胞系中分別回補(bǔ)野生型HDAC2-WT和HDAC2-K51Q突變型，發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)HDAC2-WT可以逆轉(zhuǎn)Aspirin對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，但回補(bǔ)模擬乙酰化的HDAC2-K51Q突變型則無(wú)此作用.以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了HDAC2可能是Aspirin抑制腫瘤細(xì)胞增殖的底物之一.綜上所述，Aspirin可以為HDAC2提供乙?；蛊湟阴；⒁种破淙ヒ阴；钚?，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這為研究Aspirin抗腫瘤的機(jī)制提供新的思考.

HDACIs在血液和淋巴瘤的治療上取得了一定的成效，但HDACIs單用藥對(duì)實(shí)體瘤的療效卻并不顯著[34-35]，這可能是由于泛HDACIs在實(shí)體腫瘤中同時(shí)發(fā)揮了抑癌和促癌的雙重效應(yīng)[36]，也可能是HDACIs在實(shí)體瘤中抗癌效應(yīng)并不穩(wěn)定[37].SAHA是Merck公司開發(fā)的第一個(gè)HDACIs，并于2006年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤.但相關(guān)臨床數(shù)據(jù)表明，HDACIs雖然具有較好的抗腫瘤效果，但同時(shí)也表現(xiàn)出較大的毒性，且存在半衰期短，用藥量大等缺陷，大劑量使用還會(huì)造成疲勞、腹瀉、厭食、脫水、骨髓抑制和血小板減少癥等副作用[38].因此，開發(fā)新型HDACIs或?qū)DACIs與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用可以產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果，減少不良反用.研究表明，Aspirin和其他藥物聯(lián)合使用，可以更好地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng).Aspirin和COX-2抑制劑聯(lián)合使用可以降低結(jié)腸癌患者的復(fù)發(fā)率，提高患者的生存年限[39]，Aspirin與免疫檢查點(diǎn)阻滯劑聯(lián)用，可以達(dá)到更強(qiáng)的抗腫瘤免疫治療效果[40].2017年，美國(guó)預(yù)防服務(wù)工作組(US Preventive Services Task Force, USPSTF)將Aspirin作為結(jié)腸癌的預(yù)防用藥[41].因此，本研究為靶向HDACIs的聯(lián)合用藥提供了新的思路和開研發(fā)方向，有助于開發(fā)副作用更小的抗癌藥物.

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了Aspirin能夠直接乙酰化HDAC2并抑制其去乙?；钚?，且HDAC2可能是Aspirin發(fā)揮抗腫瘤作用的底物之一，同時(shí)HDAC2還能夠發(fā)生自身去乙酰化.這為探究Aspirin抗腫瘤的功能和機(jī)制提供了方向，同時(shí)也為開發(fā)更為有效的聯(lián)合用藥策略提供了理論基礎(chǔ).