基因組Ⅰ型和Ⅴ型傳染性胰臟壞死病毒的分離與鑒定

段凱越，趙景壯，任廣明,4，邵軼智，盧彤巖, 4，何保全，徐黎明*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 3.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)動植物病原庫，上海 201306； 4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223)

虹鱒Oncorhynchusmykiss是中國主要冷水魚養(yǎng)殖品種，廣泛分布在中國東北、西北、西南等冷水資源較發(fā)達(dá)的地區(qū)，在帶動當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展、促進(jìn)漁民增收方面發(fā)揮了積極的作用。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、苗種的頻繁流通，虹鱒病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了冷水魚養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展。

傳染性胰臟壞死病(infectious pancreatic necrosis，IPN)是一種全球流行性疾病，于20世紀(jì)50年代在美國開始流行[1]，至今已傳播到法國[2]、土耳其[3]、智利[4]、墨西哥[5]、芬蘭[6]、挪威[7]、西班牙[8]、日本[9]、韓國[10]和伊朗[11]等國家，給鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。該病是由傳染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)引起的一種病毒性疾病，主要威脅鮭科魚類。IPNV隸屬于雙RNA病毒科Birnavirdate水生雙RNA病毒屬Aquabirnavirus，其病毒粒子無囊膜包裹，呈二十面體。IPNV的基因組由A和B兩條RNA組成。A鏈包含兩個重疊的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中較大的ORF編碼外衣殼蛋白VP2、內(nèi)衣殼蛋白VP3和蛋白酶VP4，小ORF編碼非結(jié)構(gòu)多肽VP5[12-13]。B鏈編碼RNA依賴性RNA聚合酶VP1，用于轉(zhuǎn)錄和復(fù)制病毒基因組[14-15]。利用交叉中和測定法可將水生雙RNA病毒分為A和B兩個血清群(serogroup)[16]，其中，血清群A包含9種血清型，即A1(West Buxton，WB)、A2(Spajarup，Sp)、A3(Abild，Ab)、A4(Hecht，He)、A5(Tellina，Te)、A6(Canada 1，C1)、A7(Canada 2，C2)、A8(Canada 3，C3)和A9(Jasper，Ja)[17]，血清群B僅具有血清型B1。利用系統(tǒng)發(fā)育分析方法，可將水生雙RNA病毒分為7個基因型，包括基因組Ⅰ～Ⅶ(genogroup Ⅰ～Ⅶ)。目前IPNV基因型主要分布在基因組Ⅰ～Ⅵ[18]。中國于20世紀(jì)80年代首次暴發(fā)IPN疫情。該病在中國已經(jīng)流行了30余年，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為制約中國鮭鱒魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。已知的中國境內(nèi)分離的IPNV為基因組Ⅴ型和基因組Ⅰ型[19-23]。

2020年，中國西北某虹鱒養(yǎng)殖場幼魚發(fā)生持續(xù)性死亡，死亡歷程延續(xù)4個月之久，累計死亡率近20%。為探究造成虹鱒幼魚死亡的病因，本研究團(tuán)隊開展了流行病學(xué)調(diào)查工作，本研究中對患病虹鱒進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察，對病原進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行了病毒分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析、電鏡觀察及人工回歸感染試驗，以期為虹鱒養(yǎng)殖業(yè)中的疾病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞(chinook salmon embryo cells，CHSE-214)和胖頭鱥上皮細(xì)胞(epithelioma papulosum cyprini, EPC)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所魚類病害教研室曾令兵研究員惠贈。PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒、Trizol試劑、DL2000 marker購自寶生物工程(大連)有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰酶(體積分?jǐn)?shù)0.25%的EDTA-Tyrisin)、M199培養(yǎng)基購自Gibco公司。健康虹鱒(平均體質(zhì)量5 g)購自遼寧本溪艾格莫林實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本信息及組織病理學(xué)觀察 本試驗中共采集了3份患病虹鱒樣品，分別取自發(fā)病養(yǎng)殖場的孵化車間(體質(zhì)量3～5 g，命名為F1)及養(yǎng)殖區(qū)域的兩個不同網(wǎng)箱(體質(zhì)量20～30 g，分別命名為W1和W2)。分別取患病魚的肝、脾及腎組織，使用波恩氏液進(jìn)行固定。用石蠟包埋制作切片后進(jìn)行H.E染色。采用中性樹脂膠封片后，利用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理變化。

1.2.2 病毒的分離培養(yǎng) 取患病虹鱒的肝、脾、頭腎組織混合勻漿，4 ℃下以12 000 r/min 離心5 min。用0.22 μm無菌過濾器對離心后的上清液進(jìn)行無菌處理，然后用細(xì)胞維持液(含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和鏈霉素的M199培養(yǎng)基)將無菌組織勻漿上清液稀釋10倍接種于CHSE-214及EPC單層細(xì)胞，于15 ℃培養(yǎng)箱中吸附1 h后棄上清液，補加細(xì)胞維持液后置于15 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d內(nèi)每天利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。若出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)，則待80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物儲存于-80 ℃超低溫冰箱中；若未出現(xiàn)細(xì)胞病變，將細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行盲傳，如果7 d內(nèi)觀察到細(xì)胞病變則收獲細(xì)胞培養(yǎng)液存于-80 ℃超低溫冰箱中，若無細(xì)胞病變則判定該樣本為目標(biāo)病毒陰性。

1.2.3 病毒的RT-PCR鑒定 根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)傳染性造血器官壞死病毒診斷規(guī)程(GB/T 15805.2—2017)[24]合成擴(kuò)增傳染性造血器官壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)部分G基因的引物，其擴(kuò)增片段大小為693 bp。根據(jù)文獻(xiàn)[25]合成擴(kuò)增IPNV部分VP2基因的引物，其擴(kuò)增片段大小為584 bp。以Trizol試劑提取的上述細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA為模板，使用One Step RT-PCR Kit，分別利用上述引物對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。一步法RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的步驟為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃下預(yù)變性4 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸60 s，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72 ℃下終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。陽性PCR樣本由吉林省庫美生物(中國長春)純化并進(jìn)行基因序列測定。利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的BLAST對鑒定的基因序列進(jìn)行比對分析。

1.2.4 IPNV系統(tǒng)發(fā)育分析 選用VP2基因序列，使用MEGA X軟件中的最大似然法，采用自展值(bootstrap)為1 000[26]，最佳核苷酸代替模型為GTR+G，對分離的IPNV毒株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用Megalign軟件計算本研究中分離的IPNV毒株與基因組Ⅰ～Ⅶ型水生雙RNA病毒VP2基因序列的一致性。本研究中使用的參考毒株信息見表1。

表1 本研究所用的參考毒株

1.2.5 IPNV的電鏡觀察 收集出現(xiàn)細(xì)胞病變的CHSE-214細(xì)胞，用PBS磷酸緩沖溶液洗滌3次，用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液在4 ℃下固定24 h。然后用體積分?jǐn)?shù)1%的四氧化鋨在25 ℃下固定70 min并使用乙醇溶液脫色。用丙酮沖洗細(xì)胞后，將其包埋在樹脂中，用乙酸鈾酰-檸檬酸鉛染色，然后使用透射電子顯微鏡(Hitachi 7650,日本)對細(xì)胞內(nèi)病毒粒子進(jìn)行觀察[27]。

1.2.6 IPNV滴度的測定 使用CHSE-214細(xì)胞對IPNV分離株的半數(shù)組織培養(yǎng)物感染劑量(tissue culture infective dose，TCID50)進(jìn)行測定。具體方法如下：將CHSE-214細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞匯合成單層細(xì)胞，將體外傳代3次的IPNV病毒懸液用細(xì)胞維持液進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-8)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接8個孔，每孔接100 μL。同時設(shè)置只添加細(xì)胞維持夜的細(xì)胞作為陰性對照。將接種好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于15 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，對出現(xiàn)病變及未病變的細(xì)胞孔進(jìn)行計數(shù)，并按Reed-Muench公式計算IPNV分離株的滴度。

1.2.7 人工回歸感染試驗 隨機(jī)將虹鱒分為4組，每組30尾。攻毒組為健康虹鱒腹腔注射IPNV細(xì)胞培養(yǎng)物(0.1 mL/尾)，對照組為健康虹鱒腹腔注射空白細(xì)胞培養(yǎng)物(0.1 mL/尾)。攻毒后將虹鱒置于15 ℃循環(huán)水族箱中隔離喂養(yǎng)，每天記錄虹鱒的臨床癥狀及死亡情況。分別在攻毒后的第30天和第60天，從每組取5尾魚的肝、脾、頭腎組織分別混合，按照每克組織加10 mL PBS溶液的比例進(jìn)行勻漿，4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，組織勻漿上清用0.22 μm無菌濾膜過濾，進(jìn)行10倍梯度稀釋并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按“1.2.6節(jié)”中的方法測定IPNV在組織中的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病魚臨床癥狀及組織病理學(xué)觀察

患病虹鱒表現(xiàn)為離群，上浮于水面，游動緩慢，出現(xiàn)眼球突出(圖1A)、體色發(fā)黑(圖1C)、腹部及脾臟腫大和肝臟蒼白等癥狀(圖1B)。組織病理學(xué)觀察顯示，患病魚肝脾腎組織細(xì)胞廣泛性壞死、空泡化、溶解，腎小球結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞溶解。

A～C—患病魚臨床癥狀；D—正常虹鱒的肝；E—正常虹鱒的脾；F—正常虹鱒的腎；G—患病虹鱒的肝；H—患病虹鱒的脾；I—患病虹鱒的腎。

2.2 病毒的細(xì)胞分離

取患病虹鱒的肝、脾、頭腎組織制備勻漿后分別接種CHSE-214及EPC細(xì)胞，進(jìn)行鮭鱒常見病毒分離。接種后48 h,各組CHSE-214細(xì)胞均出現(xiàn)明顯病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變薄、消融、出現(xiàn)圓形膜結(jié)構(gòu)，而此時的EPC細(xì)胞則無任何病變；在接毒后72 h，各組CHSE-214細(xì)胞大面積崩解，脫落嚴(yán)重，80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)崩解，接種W1和W2的EPC細(xì)胞開始變圓，部分脫落，而接種F1樣品的EPC細(xì)胞盲傳后仍無細(xì)胞病變(圖2和圖3)；陰性對照CHSE-214和EPC細(xì)胞狀態(tài)始終正常。

圖2 接種IPNV后CHSE-214細(xì)胞的病變

2.3 病毒的RT-PCR鑒定

對出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物(包括F1、W1和W2接種的CHSE-214細(xì)胞及W1和W2接種的EPC細(xì)胞)進(jìn)行總RNA提取，利用IHNV和IPNV的鑒定引物進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，全部細(xì)胞培養(yǎng)物在IPNV鑒定中均獲得了與目的條帶大小相符的特異性條帶(584 bp)，而在IHNV鑒定中未觀察到任何條帶，陽性對照及陰性對照泳道均正常(圖4)。測序結(jié)果顯示，同一樣品接種CHSE-214和EPC細(xì)胞分離獲得的病毒株目的基因序列一致，而不同樣品之間的目的基因序列不同。將擴(kuò)增獲得的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，上述基因序列與IPNVVP2基因的同源性最高，序列一致性高達(dá)99.81%～99.05%。將分離獲得的病毒分別命名為IPNV-F1、IPNV-W1、IPNV-W2。

M—DL2000 DNA marker；P—陽性對照；N—陰性對照；IHF1、IHW1、IHW2—IHNV的鑒定；IPF1、IPW1、IPW2—IPNV的鑒定。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中獲取基因組Ⅰ～Ⅶ 型的水生雙RNA病毒VP2基因序列，采用本研究中RT-PCR鑒定獲得的IPNVVP2基因片段序列，對IPNV毒株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，本研究中分離的IPNV毒株分屬兩種不同的基因型，IPNV-F1和IPNV-W2屬于基因組Ⅰ型，IPNV-W1屬于基因組Ⅴ型；IPNV-F1和IPNV-W2分別與中國IPNV分離株WZ2016及ChRtm213具有最近的親緣關(guān)系，VP2基因序列一致性分別為100%和98.5%；IPNV-W1與同屬基因組Ⅴ型的意大利毒株IPNV/O.mykiss/I/PN/208/Mar88(MG543567)具有最近的親緣關(guān)系，二者的VP2基因片段序列一致性為99.1%(圖5)。

圖5 基于VP2基因片段序列構(gòu)建的水生雙RNA病毒系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 IPNV分離株的電鏡觀察

將IPNV分離株接種于CHSE-214細(xì)胞48 h后，制備超薄切片進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果顯示，在細(xì)胞質(zhì)中觀察到呈晶格狀排列的無囊膜多面體IPNV病毒粒子，符合IPNV病毒粒子胞內(nèi)排列特點(圖6)。

圖6 IPNV分離株的電鏡觀察

2.6 IPNV分離株滴度的測定

將IPNV病毒懸液以10倍梯度稀釋后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于15 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，記錄病變及未病變細(xì)胞孔的數(shù)目，按照Reed Muench公式，計算出3株IPNV分離株的平均滴度分別為107.43TCID50/0.1 mL(IPNV-F1)、107.30TCID50/0.1 mL(IPNV-W1)和107.29TCID50/0.1 mL(IPNV-W2)。

2.7 人工回歸感染試驗

將3株IPNV分離株分別以0.1 mL/尾的劑量腹腔注射健康虹鱒，觀察到虹鱒體色發(fā)黑、眼球突出、拖管狀透明糞便等臨床癥狀，但是攻毒后60 d內(nèi)未觀察到虹鱒魚死亡。對攻毒虹鱒肝、脾、腎組織內(nèi)IPNV含量的測定發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，虹鱒組織中的病毒滴度逐漸下降，在攻毒后30 d，IPNV在虹鱒肝脾腎組織的平均滴度分別為104.50TCID50/0.1 g組織(IPNV-F1)、105.38TCID50/0.1 g組織(IPNV-W1)及104.13TCID50/0.1 g組織(IPNV-W2)，而在攻毒后60 d，IPNV在虹鱒組織中的平均滴度逐步下降為103.43TCID50/0.1 g組織(IPNV-F1)、104.50TCID50/0.1 g組織(IPNV-W1)及103.21TCID50/0.1 g組織(IPNV-W2)。

3 討論

3.1 中國養(yǎng)殖虹鱒病毒的流行病學(xué)調(diào)查

IHNV和IPNV是危害虹鱒的兩種主要病毒，中國學(xué)者于20世紀(jì)80年代在國內(nèi)養(yǎng)殖場便分離到了這兩種病毒。目前,這兩種病毒仍然是中國鮭鱒養(yǎng)殖環(huán)境最主要的病毒，并且自然條件下虹鱒能夠共感染這兩種病毒[28]。IHNV感染及IPNV感染均可導(dǎo)致虹鱒游動遲緩、離群，體色發(fā)黑、眼球突出，糞便呈管狀透明白色等癥狀。本研究中采集的虹鱒樣本臨床癥狀與上述癥狀相符。綜合以上因素，本研究中針對這兩種病毒開展了分離鑒定工作，利用國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的細(xì)胞系進(jìn)行了病毒的分離，結(jié)果從該發(fā)病養(yǎng)殖場成功分離出IPNV毒株。本實驗室人員此前曾從該養(yǎng)殖場網(wǎng)箱養(yǎng)殖虹鱒中分離出IHNV毒株，并且此次檢測時該養(yǎng)殖場環(huán)境條件也符合IHNV發(fā)病條件，但是并未在患病魚體內(nèi)檢測到IHNV，只檢測到了IPNV。曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，虹鱒共感染IPNV和IHNV時，IPNV對IHNV具有抑制作用[29]。本研究中未檢測到IHNV可能與該抑制作用有關(guān)，但是有待進(jìn)一步流行病學(xué)調(diào)查研究驗證。本實驗室曾檢出過IHNV/IPNV共感染病例[30]，當(dāng)時共感染病例在一個月內(nèi)累計死亡率高達(dá)80%以上。本次發(fā)病虹鱒4個月內(nèi)累計死亡率僅為20%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于已報道的IHNV感染病例或者IHNV/IPNV共感染病例。根據(jù)毒株、宿主種類及大小、環(huán)境因素的差異，IPNV感染可導(dǎo)致虹鱒截然不同的死亡率，因此，應(yīng)進(jìn)一步加強傳染性胰臟壞死病的流行病學(xué)研究深度與廣度，充分掌握其病原學(xué)數(shù)據(jù)，為傳染性胰臟壞死病的科學(xué)防控提供參考。

3.2 中國IPNV毒株的基因型與血清型

VP2是IPNV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其上有中和抗體表位，能誘發(fā)宿主機(jī)體產(chǎn)生抗體免疫反應(yīng)[31]，根據(jù)該基因的不同，可將水生雙RNA病毒分為7個基因型[18]。這7個基因型一共包含10種血清型。中國最初分離到的IPNV均為SP血清型[21-23]、基因組Ⅴ型，近年有報道稱在國內(nèi)虹鱒養(yǎng)殖場分離到了基因組Ⅰ型的IPNV[19-20]。本研究中，在同一養(yǎng)殖場同時獲得了這兩種基因型的IPNV毒株，進(jìn)一步證明了相同的養(yǎng)殖環(huán)境可同時存在這兩種基因型的IPNV。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)中和抗體，未對本研究中分離的IPNV毒株進(jìn)行中和抗體試驗，因此，其血清型仍然未知。本研究中所分離的IPNV-F1和IPNV-W2屬于基因組Ⅰ型，其中IPNV-F1與中國IPNV分離株ChRtm213(云南省)同源性最高，IPNV-W2與中國IPNV分離株WZ2016(四川省)同源性最高，這兩株IPNV與日本的AM-98(AY283780)具有較高的同源性。而IPNV-W1則屬于基因組Ⅴ型，由于目前GenBank數(shù)據(jù)庫中未收錄中國基因組Ⅴ型IPNV毒株VP2基因序列，因此，無法得知該分離株與國內(nèi)其他基因組Ⅴ型IPNV毒株的同源性，但是經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，該毒株與意大利毒株IPNV/O.mykiss/I/PN/208/Mar88同源性最高。同源性的高低一定程度上反映病毒進(jìn)化來源關(guān)系，同源性越高表明來源自同一原始毒株的可能性越大。因此，中國IPNV毒株很可能與日本及意大利毒株來源于相同的原始祖先。由于IPNV能以水平傳播的方式感染宿主，養(yǎng)殖場在引進(jìn)種苗的過程中應(yīng)加強對IPNV的監(jiān)控力度，避免攜帶IPNV魚苗的流通。

3.3 IPNV分離株的毒力特性

本研究中，利用CHSE-214及EPC細(xì)胞對組織病料進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的IPNV分離株均能在CHSE-214細(xì)胞上生長并產(chǎn)生典型細(xì)胞病變，其中2株IPNV毒株可以在EPC細(xì)胞上生長并產(chǎn)生細(xì)胞病變。但是IPNV在EPC細(xì)胞上出現(xiàn)細(xì)胞病變所需時間較在CHSE-214細(xì)胞上出現(xiàn)細(xì)胞病變的時間長。該結(jié)果表明，CHSE-214更適合用作IPNV分離的敏感細(xì)胞系。因此，本研究中利用CHSE-214細(xì)胞對所獲得IPNV分離株進(jìn)行了滴度測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3株IPNV分離株的細(xì)胞毒力無顯著差異，均可達(dá)107TCID50/0.1 mL。盡管各IPNV分離株在CHSE-214細(xì)胞上具有較高的滴度，采用0.1 mL/尾病毒原液的劑量對虹鱒進(jìn)行人工回歸感染試驗，但仍未能造成虹鱒死亡。此前，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[32]，對虹鱒進(jìn)行攻毒，其死亡率較低且臨床癥狀不明顯。Bruslind等[33]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，強毒株IPNV易感染魚苗但未表現(xiàn)出臨床癥狀，并且病毒在宿主中復(fù)制的能力與其對魚的致死能力無關(guān)。由此可知，盡管自然暴發(fā)傳染性胰臟壞死病會造成虹鱒大規(guī)模死亡，但是IPNV攻毒模型的建立仍然存在困難，因此，多數(shù)學(xué)者均采用測定試驗動物體內(nèi)病毒載量來對傳染性胰臟壞死病疫苗效果進(jìn)行評價[34]。但是該方法存在一定的局限性，無法直接反映疫苗的保護(hù)率。因此，今后應(yīng)針對IPNV開展更深入的基礎(chǔ)研究，為傳染性胰腺壞死病的科學(xué)防控提供指導(dǎo)。

4 結(jié)論

1) 本研究首次從同一養(yǎng)殖場患病虹鱒體內(nèi)分離到基因組Ⅰ型(命名為IPNV-W2和IPNV-F1)和基因組Ⅴ型(命名為IPNV-W1)的IPNV毒株，其中，IPNV-W2和IPNV-F1分別與中國IPNV分離株WZ2016(KX355401)和ChRtm213(KX234591)同源性最高，IPNV-W1與意大利的IPNV分離株同源性最高。

2) 盡管本研究中分離的IPNV毒株在CHSE-214細(xì)胞上具有較高的滴度，也能很好地在虹鱒體內(nèi)繁殖，但人工回歸感染并未造成虹鱒死亡。