徐澎 Muhammad Junaid 劉燕 陳裕鵬 畢春晴 許楠
深圳市重金屬污染控制與資源化重點實驗室, 北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院, 深圳 518055;
全氟辛烷磺酸類物質(zhì)(perfluorooctane sulfonate,PFOS, 包括全氟辛烷磺酸及其鹽類物質(zhì))是持久性有機污染物(POPs)的典型代表。近年來, 越來越多的研究發(fā)現(xiàn) PFOS 對水生生物具有廣泛的毒性效應(yīng)[1]。此外, 早在 20 世紀 70 年代就出現(xiàn)有關(guān)海洋環(huán)境中塑料碎片的報道[2]。2004 年, Thompson 等[3]第一次提出微塑料(Microplastics, MP)概念, 國際上通常將直徑小于 5 mm 的塑料碎片或顆粒定義為微塑料[4]。海洋中微塑料污染的來源比較廣泛, 主要分為 3 個方面: 1) 陸源輸入; 2) 海源輸入; 3) 海岸線上人類活動帶來的微塑料污染。
微塑料廣泛存在, 在自然作用下能夠變成更小的表面更加不規(guī)則的微粒, 這些微粒具有較大的比表面積, 可以吸附海水中其他污染物, 成為這些污染物進入水生生物的載體。因此, 要闡明微塑料在水環(huán)境中真實的生態(tài)風(fēng)險, 對微塑料單一毒性效應(yīng)的研究遠遠不夠, 需要結(jié)合微塑料與其他污染物之間的相互作用來進行綜合評估。目前, 微塑料與其他污染物綜合生態(tài)風(fēng)險效應(yīng)的研究在目標污染物選取方面集中在多環(huán)芳烴(PAHs)、有機氯農(nóng)藥、石油烴、雙酚 A、多氯聯(lián)苯(PCBs)、多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)[5–8]和一些重金屬(如銅、鉻和鉛等)[9–10]。近年來, 全氟化合物、藥物及個人護理品(PPCPs)等新型污染物與微塑料相互作用的研究逐漸增多[11–12]。對微塑料在水生生物中復(fù)合毒性效應(yīng)的研究與單一毒性效應(yīng)的研究類似, 主要毒理指標包括濾食行為、死亡率、生長產(chǎn)卵情況、氧化應(yīng)激系統(tǒng)響應(yīng)情況、相關(guān)炎癥反應(yīng)以及特定基因表達等分子生物學(xué)層面的效應(yīng)。有關(guān)污染物在水環(huán)境中的毒性效應(yīng),一般選取底棲生物作為研究對象,特別是貽貝類(如翡翠貽貝和紫貽貝), 通常作為評估水生環(huán)境健康狀況和監(jiān)測海洋污染的指示生物。
基于上述背景, 本研究針對海洋生態(tài)研究的最新趨勢, 探索 PFOS 或微塑料單獨暴露以及二者復(fù)合暴露對翡翠貽貝濾食率、活性氧水平(ROS)、抗氧化系統(tǒng)(超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和谷胱甘肽還原酶(GR)活性)以及丙二醛(MDA)含量的影響, 以期為海洋水質(zhì)評價、水產(chǎn)品安全評估及微塑料和PFOS 污染的有效控制提供科學(xué)依據(jù)。
全氟辛烷磺酸鉀(C8F17KO3S, >98%)、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和中性紅均購自上海麥克林生化科技有限公司, 純度為 AR 級。微塑料小球購自加拿大 Invitrogen 公司, 材質(zhì)為聚苯乙烯, 直徑為 0.2 μm。蛋白試劑盒、ROS 試劑盒、SOD 試劑盒、CAT 試劑盒、GSH-ST 試劑盒、GR 試劑盒和 MDA 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。實驗用水為 Milli-Q 超純水。
野生型翡翠貽貝(Perna viridis)購自廣東省深圳市蛇口海鮮市場。暴露實驗前, 將翡翠貽貝在實驗室馴化一周。馴化容器為兩個 30 L 塑料容器, 馴化用海水取自遠離海岸的深層自然海水, 經(jīng) 0.7 μm 濾膜過濾。馴化期間海水溫度維持在 25°C 左右, 鹽度維持在 32‰, 12 小時交替施加人工光源, 晝夜不間斷地曝氣。喂食用小球藻Chlorella vulgaris購自湖北省武漢市中國科學(xué)院水生生物研究所, 喂養(yǎng)濃度維持在 1.25×106cells/L。馴化結(jié)束后, 選擇色澤健康且身長在 7~8 cm 的翡翠貽貝進行暴露實驗。
馴化完畢后, 使用 10 L 塑料容器進行暴露實驗。加入 8 L 過濾后的自然海水(未檢出 PFOS), 定量地添加 PFOS 溶液和微塑料溶液, 二者混合暴露實驗濃度設(shè)置如表 1 所示。PFOS 使用 DMSO 助溶,助溶劑濃度≤ 0.1 mL/L。待污染物在固液兩相分配平衡后, 加入大小均勻(7~8 cm)的 14 只翡翠貽貝,調(diào)節(jié)溫度為 25 °C, 鹽度為 32‰。通過不斷地曝氣,既可以滿足翡翠貽貝的需氧量, 還有助于微塑料小球分散均勻。調(diào)節(jié)人工光照, 保持晝夜各 12 小時,每天早晚兩次定時投喂小球藻, 每兩天更換一次海水。同時設(shè)置溶劑空白對照體系(加入 0.8 mL DMSO, 不加 PFOS 和微塑料)和平行實驗體系(3 組平行)。暴露實驗時長為 7 天。
表1 PFOS 和微塑料暴露實驗二元混合設(shè)計方案Table 1 Experimental design of PFOS and microplastics exposure
濾食率的測定參考 Cooper 等[13]的研究方法。7天暴露實驗完成后, 從各暴露組隨機取出一只翡翠貽貝, 放入 500 mL 塑料燒杯中。每個燒杯中加入200 mL 1 mg/L 的中性紅溶液, 避光靜置 2 小時。每個暴露組進行 3 次濾食率的測定。使用紫外–可見分光光度計(DR6000, 美國哈希公司)測量濾食前、后燒杯中溶液的吸光度(波長設(shè)定為 530 nm), 利用標準曲線換算出對應(yīng)的中性紅濃度, 進一步根據(jù)下式計算各暴露組翡翠貽貝的濾食率。
其中,m代表濾食率(mL/(只·h)),M代表中性紅溶液的體積(M=200 mL),n代表測試中翡翠貽貝的個數(shù)(n=1),t代表測定時長(t=2 h),C0代表中性紅溶液原始濃度,Ct代表濾食2 小時后中性紅的濃度。
活性氧的測定采用熒光探針法。首先使用酶消化法, 將翡翠貽貝各器官制備成單細胞懸液, 隨后加入 DCFH-DA (2,7-dichlorofuorescin diacetate), 初始工作濃度為 10 μM。37°C 孵育細胞 30 分鐘, 收集孵育(探針標記)后的單細胞懸液, 1000g離心 5~10 分鐘, 收集單細胞, 用 PBS 洗滌 1~2 次, 離心收集細胞沉淀物重懸后, 利用多功能微孔板酶標儀(Envision 2104, 美國 PerkinElmer 公司)進行熒光測定, 激發(fā)波長為 500 nm、發(fā)射波長為 520 nm。同時取部分單細胞懸液, 經(jīng)勻漿破碎處理后, 進行蛋白的測定。ROS 結(jié)果表示為熒光度值/毫克蛋白。
SOD 活性、CAT 活性、GSH-ST 活性、GR 活性和 MDA 含量的測定均按試劑盒說明書操作。首先將翡翠貽貝各器官利用全自動研磨機(JXFSTPRP-32,上海凈信公司)研磨成組織勻漿, 再按照預(yù)實驗推算出的各指標測定最佳濃度進行稀釋。需要注意的是, 測定 MDA 使用的是離心前的組織勻漿。各指標最佳測定濃度、取樣量、對應(yīng)的測定波長和測定方法列在表 2 中。最佳測定濃度和最佳取樣量均根據(jù)試劑盒說明書, 進行多次實驗測試得出, 為本實驗翡翠貽貝特定的測定濃度和取樣量。除CAT 活性的測定使用酶標儀以外, 其他酶活性和MDA 濃度的測定均使用紫外–可見分光光度計。
表2 氧化應(yīng)激各指標最佳測定濃度、取樣量、對應(yīng)的測定波長和測定方法Table 2 Measurement methods and the optimal testing concentration, sampling volume, corresponding measurement wavelength for different oxidative stress indicators using tissues homogenate
實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差的形式表示。方差齊性檢驗采用 Levene 檢驗。組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 兩兩比較方差齊者采用 LSD 檢驗。顯著性差異值被設(shè)定為 3 個梯度(p<0.05,p<0.01,p<0.001)。所有的數(shù)據(jù)分析均在 SPSS 20.0 軟件上進行。
如圖 1 所示, 無論單獨暴露于微塑料, 或單獨暴露于 PFOS, 或共暴露于 PFOS 和微塑料后, 翡翠貽貝中濾食率比溶劑對照組有些微提升, 但顯著性檢驗結(jié)果顯示, 這種提升不顯著。并且, 微塑料和PFOS 共暴露比 PFOS 單獨暴露沒有顯著地影響翡翠貽貝的濾食率。Liu 等[14]同樣發(fā)現(xiàn), 貝類濾食率對全氟辛酸(PFOA)缺乏顯著的響應(yīng)。Cooper 等[13]在前期實驗中也發(fā)現(xiàn), 河蜆暴露于有機磷殺蟲劑后,其濾食率并沒有發(fā)生顯著的變化。
圖1 暴露于微塑料和PFOS 后翡翠貽貝的濾食率Fig. 1 Filtration rate of Perna viridis exposed to PFOS and microplastics (MP)
一般來說, 貝類的濾食率會隨著污染物的暴露而降低。Liu 等[15]的研究結(jié)果顯示, 在翡翠貽貝暴露于 PFOS 后, PFOS 暴露濃度最高時, 濾食率比空白對照組顯著降低。該研究認為, 雙殼類動物打開它們的入水管, 通過鰓促進水的自由循環(huán), 利用該過程呼吸和進食, 而這種基本的生理活動會受到PFOS 暴露的影響。Yan 等[16]發(fā)現(xiàn), 河蜆Corbicula fluminea的濾食率在受到污染后呈下降趨勢, 說明磷酸三酯(TBEP)和磷酸三丁酯(TBP)的暴露觸發(fā)了河蜆對污染物的防御系統(tǒng)。也有研究表明, 隨著體內(nèi)污染物的增加, 貝類會選擇通過關(guān)閉瓣膜, 減少濾食, 進而降低代謝率、心跳和耗氧量[17]。本研究中未發(fā)現(xiàn)微塑料和 PFOS 的暴露對翡翠貽貝的濾食率產(chǎn)生顯著影響, 可能與暴露時間長短、翡翠貽貝來源、PFOS 濃度和微塑料濃度等因素有關(guān)。
由圖 2 可知, 無論單一的 PFOS 暴露, 還是聯(lián)合的 PFOS-MP 暴露, 翡翠貽貝體內(nèi)的 ROS 水平均隨PFOS 暴露濃度的升高而升高。Liu 等[18]發(fā)現(xiàn), 淡水羅非魚(Oreochromis niloticus)中的 ROS 水平也與PFOA 的暴露劑量成正比。Li 等[19]研究了 2,4–二氯苯酚(2,4-DCP)對草魚Ctenopharyngodon idella的影響, 結(jié)果顯示, 2,4-DCP 顯著提高了草魚中的 ROS水平, 并誘導(dǎo)原代肝細胞的凋亡。Dong 等[20]研究五氯酚(PCP)對黑鯽Carassius carassius肝細胞的影響后發(fā)現(xiàn), PCP 誘導(dǎo)細胞內(nèi) ROS 的生成, 而且 ROS極有可能參與 PCP 誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。另外, 在本研究中, 當(dāng)翡翠貽貝僅暴露于微塑料時, 內(nèi)臟團中ROS 水平顯著升高, 鰓和性腺中 ROS 水平未見明顯變化。Jeong 等[21]的研究也發(fā)現(xiàn), 僅暴露于微塑料會導(dǎo)致輪蟲(Brachionus koreanus)中 ROS 水平升高。上述研究結(jié)果表明, ROS 在生物體對污染物的應(yīng)激反應(yīng)中起到關(guān)鍵性紐帶作用, 而 PFOS 和微塑料的暴露都有可能引起 ROS 水平的提高。
圖2 暴露于微塑料和PFOS 后翡翠貽貝體內(nèi)不同器官(鰓、內(nèi)臟團和性腺)的ROS 水平Fig. 2 Effect of microplastics (MP) and PFOS on reactive oxygen species levels (ROS) in gills,visceral mass and gonads of Perna viridis
脂質(zhì)過氧化是氧化應(yīng)激的標志, 可以通過測定丙二醛(MDA)來進行評價[22]。本研究中, 與溶劑對照組(鰓、內(nèi)臟團和性腺 MDA 含量分別為 12.24,19.45 和 27.63 nmol/mgprot)相比, MDA 含量在微塑料單獨暴露實驗組和 1000 μg/L PFOS 單獨暴露實驗組均顯著提高(圖 3)。另外, 與 1000 μg/L PFOS 單獨暴露實驗組或微塑料單獨暴露實驗組相比, 1000 μg/L PFOS-MP 共暴露實驗組中鰓和內(nèi)臟團的 MDA含量顯著提高(p<0.001)。Dong 等[20]研究五氯酚(PCP)對黑鯽Carassius carassius肝細胞的影響, 發(fā)現(xiàn) MDA 劑量依賴性增加, 而谷胱甘肽(GSH)劑量依賴性減少, 表明 PCP 通過影響多個靶點誘導(dǎo)肝細胞的凋亡。楊濤等[23]研究菲對紅鰭笛鯛的影響, 結(jié)果表明在各種暴露濃度條件下, 暴露時間越長, 目標生物肝和鰓組織中的 MDA 含量越高。有研究發(fā)現(xiàn),MDA 含量的增加可能是由 ROS 的增加引起的[24]。因此, 本研究中 MDA 含量的增加極有可能是受到ROS 水平的影響。
圖3 暴露于微塑料和 PFOS 后翡翠貽貝體內(nèi)不同器官(鰓、內(nèi)臟團和性腺)的 MDA 含量Fig. 3 Effect of microplastics (MP) and PFOS on MDA content in gills, visceral mass and gonads of Perna viridis
也有研究發(fā)現(xiàn), MDA 的含量并不是簡單地隨著暴露濃度和時間的增加而顯著地增加, 在不同的實驗條件下, MDA 含量會出現(xiàn)不同的結(jié)果。王賀威等[25]的研究表明, 翡翠貽貝暴露于 PFOS 后, 外套膜中的 MDA 含量顯著提高, 但在內(nèi)臟團中, 隨著暴露時間的增加, MDA 含量出現(xiàn)先抑制后促進的情況。黃志斐等[26]研究一溴聯(lián)苯醚(BDE3)對翡翠貽貝的影響, 發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟團中 MDA 的含量隨著暴露時間的增加并未出現(xiàn)一致性地增加或減少, 而是在提高和抑制間無規(guī)律地不斷變化, 且低濃度暴露組在第三天時 MDA 含量最高, 比對照組顯著地提高26.04%; 高暴露組在第 7 天時 MDA 含量最低, 相比對照組顯著地降低 14.92%。此外, 隨著暴露時間增加, 外套膜中 MDA 含量呈先升高再降低的趨勢。
超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶,通過催化超氧化物自由基突變?yōu)檫^氧化氫(H2O2)或普通分子氧(O2)來阻止脂質(zhì)過氧化物的形成[27], CAT則會催化 H2O2轉(zhuǎn)化為分子水。這些抗氧化酶在保護機體免受氧化應(yīng)激中起著重要的作用。本研究中, 暴露于微塑料和 PFOS 后, 與溶劑對照組(SOD活性: 鰓、內(nèi)臟團和性腺分別為 40.76, 15.38 和124.51 U/mgprot; CAT 活性: 鰓、內(nèi)臟團和性腺分別為 14.58, 5.24 和 20.89 U/mgprot)相比, 大部分實驗組的 SOD 和 CAT 活性在 3 個器官中均顯著地提高(p<0.05)(圖 4(a)和(b))。Avio 等[28]的研究表明,貽貝暴露于微塑料和芘以后, 體內(nèi)的 CAT 活性會發(fā)生異常。Liu 等[15]的研究表明, 翡翠貽貝體內(nèi) CAT活性在 PFOS 濃度為 100 μg/L 時受到影響。在本研究中, 翡翠貽貝中 CAT 的活性在 10 μg/L 時即受到影響。在性腺中, 與 10 μg/L PFOS 單獨暴露組相比,10 μg/L PFOS-MP 共暴露組中 SOD 的活性顯著提高(p<0.05)。然而, 與 100 μg/L PFOS 單獨暴露組相比,100 μg/L PFOS-MP 共暴露組中的 SOD 活性顯著降低(p<0.05)。這一結(jié)果與通常認為的共暴露能提高SOD 活性的觀點相反。Li 等[29]研究單壁碳納米管(SWCNTs)和 PFOS 對斑馬魚的影響, 結(jié)果表明在肝臟中 PFOS 單獨暴露提高 SOD 的活性, 而單壁碳納米管和 PFOS 在共暴露 72 小時和 96 小時后降低SOD 的活性, 腸道中 SOD 的活性也受到抑制。此外, 在鰓中, 單壁碳納米管和 PFOS 共暴露 24 小時和 48 小時后, SOD 的活性顯著增加。在腦中, 兩者共暴露 24 小時后誘導(dǎo) SOD 活性的顯著增加, 而在PFOS 單獨作用下, SOD 的活性保持不變。這些結(jié)果表明, 共暴露對 SOD 活性的影響可能是促進作用, 也可能是抑制作用, 但無論是抑制還是促進,共暴露均可引起斑馬魚 SOD 酶活性的顯著變化。本研究中, 無論是 PFOS 單獨暴露, 還是 PFOS 和微塑料共暴露, CAT 活性的最低值均出現(xiàn)在 100 μg/L的 PFOS 濃度條件下。此外, 除微塑料和 100 μg/L PFOS 單獨暴露組外, 其他各暴露組 CAT 的活性均顯著高于溶劑對照組。盡管不同濃度的 PFOS 會產(chǎn)生不同的結(jié)果, 但是 SOD 和 CAT 活性結(jié)果表明, 微塑料和 PFOS 共暴露會使酶活性升高或下降, 不同的酶在微塑料和不同 PFOS 濃度下表現(xiàn)出不同的活性變化, 這可能與機體的適應(yīng)機制有關(guān)[30]。
圖4 暴露于微塑料和PFOS 后翡翠貽貝體內(nèi)不同器官(鰓、內(nèi)臟團和性腺)的SOD (a)和CAT (b)活性Fig. 4 Effect of microplastics (MP) and PFOS on SOD (a) and CAT (b) activities in gills, visceral mass and gonads of Perna viridis
GST 能夠催化谷胱甘肽(GSH)與多種親電性以及疏水性化合物(包括 PFOS)結(jié)合, 并將這些代謝物轉(zhuǎn)化為易于排泄的親水化合物, 因此 GST 在細胞內(nèi)解毒中發(fā)揮重要作用[31]。本研究中, 除 10 μg/L PFOS-MP 共暴露組外, 其他共暴露組中內(nèi)臟團和性腺中 GST 的活性均顯著高于溶劑對照組(鰓、內(nèi)臟團以及性腺 GST 活性分別為 7.58, 9.90 和 10.30 U/mgprot)、PFOS 單獨暴露組及微塑料單獨暴露組(圖5(a))。這些結(jié)果表明, GST 在保護貽貝免受各種環(huán)境壓力方面發(fā)揮了重要的作用, 而共暴露促進了GST 的活性。Gülsever 等[32]將貽貝暴露于 6 種不同濃度的 PFOS 中, 結(jié)果表明, 與對照組相比, PFOS導(dǎo)致所有實驗組肝胰腺 GST 活性顯著地增加。
GR 通過將氧化態(tài)谷胱甘肽(GSSG)還原為 GSH來維持谷胱甘肽的胞質(zhì)濃度[33]。本研究中, 除鰓中10 μg/L PFOS-MP 共暴露組外, 各暴露組鰓和性腺中的 GR 活性均比溶劑對照組(鰓、內(nèi)臟團和性腺GR 活性分別為 11.73, 31.14 和 8.16 U/gprot)顯著地提升(p<0.05)(圖 5(b))。Liu 等[18]發(fā)現(xiàn), PFOS 的暴露濃度達到 30 mg/L 后, 淡水羅非魚(Oreochromis niloticus)的 GR 活性才會顯著地提升, 該濃度遠高于本研究采用的 PFOS 濃度。這種差異可能是由不同實驗?zāi)P偷拿舾行砸约安煌钠毓饨橘|(zhì)等因素造成的。也有研究表明, 污染物暴露還可能抑制 GR 的活性。Yan 等[16]發(fā)現(xiàn), 當(dāng) TBP 濃度為 2000 μg/L 時,河蜆Corbicula fluminea中 GR 的活性比對照組顯著地降低(p<0.05)。
圖5 暴露于微塑料和 PFOS 后翡翠貽貝體內(nèi)不同器官(鰓、內(nèi)臟團和性腺)的GST (a)和GR (b)活性Fig. 5 Effect of microplastics (MP) and PFOS on GST (a) and GR (b) activities in gills, visceral mass and gonads of Perna viridis
本研究涉及貽貝 3 個器官中 6 種氧化應(yīng)激指標的響應(yīng), 雖然實驗結(jié)果并未表現(xiàn)出一致的趨勢, 但是依然能夠發(fā)現(xiàn)一些規(guī)律。與低濃度的 PFOS 相比,高濃度的 PFOS 更易引起酶活性的改變; 本研究所用微塑料能夠顯著地提高內(nèi)臟團中的 ROS 水平, 進而造成 MDA 的升高; 與單獨暴露相比, PFOS 和微塑料共暴露會影響各個酶的活性, 說明微塑料的參與使得 PFOS 對貽貝的毒性效應(yīng)更加復(fù)雜, 可能與微塑料的吸附及載體作用有關(guān)。未來, 需要進一步深入研究共暴露的毒性機制。
1) 暴露于微塑料和 PFOS 后, 翡翠貽貝的濾食率比溶劑對照組沒有顯著地變化, 與 PFOS 單獨暴露組相比, 微塑料和 PFOS 共暴露對翡翠貽貝的濾食率沒有顯著的影響。
2) SOD, CAT 和 GR 的活性在單獨暴露于 10,100 和 1000 μg/L PFOS 時均顯著提高, 而 ROS 水平以及 MDA 含量僅在單獨暴露于 100 和 1000 μg/L PFOS 時顯著提高, GST 的活性僅在單獨暴露于1000 μg/L PFOS 時顯著提高。
3) 單獨暴露于微塑料后, 在鰓、內(nèi)臟團和性腺中均觀察到酶活性的改變, 表明微塑料能夠影響貽貝的氧化應(yīng)激系統(tǒng)。
4) 在微塑料和 1000 μg/L PFOS 共同暴露下, 與PFOS 單獨暴露組相比, 鰓中 ROS 水平、MDA 含量和 CAT 的活性顯著提高, GST 和 GR 的活性顯著下降; 內(nèi)臟團中 ROS 水平顯著降低, MDA 含量以及SOD、CAT 和 GR 的活性顯著提高; 性腺中 ROS 水平、GST 和 GR 的活性顯著提高, MDA 含量顯著降低。這些結(jié)果說明微塑料會改變翡翠貽貝對 PFOS的氧化應(yīng)激響應(yīng)。