應用UPLC分析荔枝果皮、假種皮可溶性糖和有機酸組分的變化

蔡燦軍，郭志雄,，潘騰飛,，尤有利，郭雅倩，李 瑞，潘東明,，佘文琴,，陳桂信,，潘鶴立,（福建農(nóng)林大學園藝學院，福州 5000；福建農(nóng)林大學園藝產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，福州 5000；福建省永春縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，福建 永春 6600）

0 引言

可溶性糖和有機酸是構(gòu)成水果風味的基本成分。作為基礎(chǔ)物質(zhì)，糖、酸組分廣泛參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等一系列基礎(chǔ)代謝活動，為機體提供能量，同時也為機體重要有機物的合成提供原料。荔枝果實中可溶性糖組分主要包括果糖、葡萄糖和蔗糖[1-3]。根據(jù)果實中還原糖和蔗糖的比例可將荔枝品種分為以蔗糖積累為主的蔗糖積累型（還原糖/蔗糖<1），以還原糖積累為主的還原糖積累型（還原糖/蔗糖>2）以及還原糖與蔗糖比例相當?shù)闹虚g積累型（1<還原糖/蔗糖<2）[4]。目前可溶性糖的測定方法主要包括比色法（蒽酮、二硝基水楊酸）和液相色譜法。傳統(tǒng)的比色法測糖方法特異性差，無法區(qū)分不同類型的糖[5]。液相色譜法過柱后通常使用示差檢測器(RID)或者蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)分析可溶性糖組分。與后者相比，前者對溫度和流速較敏感，易受溶劑峰干擾、基線不穩(wěn)定。超高液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法(UPLC-ELSD)集合了UPLC靈敏度高、分離效果好、分析速度快、操作簡單和ELSD對溫度和流速不敏感、無溶劑峰干擾、基線穩(wěn)定等優(yōu)勢，能更好地應用于可溶性糖組分的分離和定量分析[5]。

荔枝果實假種皮有機酸主要含蘋果酸、酒石酸等組分[6]，而果皮中的有機酸則未見報導，其組分組成不明。目前常用的有機酸測定方法主要有分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。分光光度計法檢出限高(>1 mg/L)，無法檢測出微量有機酸[7]；氣相色譜法在有機酸檢測時需要通過酯化的方法對有機酸進行衍生化，步驟繁瑣[8]；液相色譜法往往易受雜質(zhì)干擾而影響有機酸組分的定性定量分析；通過色譜分離聯(lián)合質(zhì)譜分析，能同時利用保留時間和離子分析對有機酸組分進行定性和定量，從而確保測定結(jié)果的準確性。而超高液相色譜-質(zhì)譜法(UPLCMS)具有樣品消耗少、靈敏度高、選擇性強、分離效果好、檢出限低等優(yōu)點。目前已被廣泛應用到許多領(lǐng)域，例如天然產(chǎn)物分析、食品分析、生化分析等[4]。

荔枝(Litchi chinensis)是中國南亞熱帶名優(yōu)果樹，其產(chǎn)量和面積均居世界首位。前人對荔枝果肉的糖、酸組分已有相關(guān)的研究分析[7,9-11]。荔枝果實構(gòu)造特殊，其果肉源于假種皮，果皮源于子房壁，兩者聯(lián)系并不緊密，相對獨立。而果皮與果實的成熟著色、采后衰老（褐變）直接相關(guān)[12-15]。目前關(guān)于荔枝果皮糖、酸組分的資料缺乏，本研究期望利用UPLC建立適合荔枝果皮和假種皮（果肉）可溶性糖、有機酸組分的測定方法，對糖酸組分進行初步的分析比較，以期為后續(xù)的果實生長發(fā)育和采后劣變等研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物材料‘烏葉’和‘蘭竹’荔枝采自福建省漳州市，分別于盛花后60天和90天采摘發(fā)育期果實和商品成熟果。果實樣本于當天早晨采摘，置于薄膜袋，放入保溫箱，襯碎冰運回實驗室。挑選無病蟲害，無碰撞，發(fā)育一致的果實。小心剝?nèi)」ぃ么罅咳ルx子水沖洗，濾紙吸干，剪取果皮2.0 g，裝于錫箔紙放入液氮中速凍；用潔凈的手術(shù)刀片切取假種皮2.0 g，裝于錫箔紙放入液氮中速凍。樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。試驗在福建農(nóng)林大學園藝產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，于2019年5—6月進行。

有機酸標樣丙酮酸(≥88.0%)、草酸(≥99.0%)、乳酸(≥88.0%)、富馬酸(≥99.0%)、琥珀酸(≥99.0%)、草酰乙酸(≥99.0%)、蘋果酸(≥99.0%)、酒石酸(≥99.0%)、莽草酸(≥99.0%)、奎尼酸(≥99.0%)、檸檬酸(≥99.0%)，可溶性糖標樣果糖(≥99.0%)、葡萄糖(≥99.0%)、蔗糖(≥99.0%)均購于上海生工生物工程公司。甲酸、氨水、無水乙醇購自國藥化工公司。甲醇、乙腈購自美國默克公司。

1.2 方法

1.2.1 荔枝可溶性糖和有機酸提取 可溶性糖和有機酸的提取參照張弦[16]、王海波等[17]和王西成等[18]的方法但略有改動。取2 g凍樣，加入80%乙醇20 mL進行勻漿，80℃水浴30 min，15000×g離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液，沉淀繼續(xù)加80%乙醇10 mL，渦旋懸浮，15000×g離心15 min，重復兩次，合并上清。提取液于55℃恒溫水浴蒸干，加入2 mL超純水溶解殘渣，離心得上清，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 UPLC-ELSD測定可溶性糖 可溶性糖UPLCELSD的建立參考龔江美[19]的方法但略有改動。超高效液相色譜儀Waters ACQUITY，蒸發(fā)光散射檢測器Altech ELSD 3300，色譜柱ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，柱溫 35℃，流速0.2 mL/min，進樣量2 μL。采用梯度洗脫，流動相A為0.2%氨水，流動相B為乙腈，梯度程序：0～14 min，16%溶劑A；14～14.5 min，16%～5%溶劑A；14.5～20 min，5%溶劑 A；20～20.5 min，5%～16%溶劑 A；20.5～30 min，16%溶劑A。ELSD條件：漂移管溫度50℃，氣體流量1.5 L/min。

1.2.3 UPLC-MS測定有機酸 超高效液相色譜儀Waters ACQUITY，檢測器Waters TUV-QDA；色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫35℃，流速0.2 mL/min，進樣量2 μL。采用梯度洗脫，流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇，梯度程序：0～6 min，100%溶劑A；6～8 min，100%～0%溶劑A；8～10 min，0%溶劑 A；10～11 min，0%～100%溶劑 A；11～15 min，100%溶劑A。MS采用負離子模式檢測，Mass采集范圍0～300m/z。

1.2.4 標準溶液配制 精密稱量可溶性糖標準品，配制成濃度為2～0.25 mg/mL的混標。精密稱量有機酸標準品，將丙酮酸、草酸、乳酸、草酰乙酸、蘋果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸、檸檬酸配制成濃度為1 mg/mL的混標，將富馬酸、琥珀酸配制成500 μg/mL和100 μg/mL的混標。標樣經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，色譜瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-ELSD條件優(yōu)化及線性相關(guān)分析

試驗對比了不同比例的流動相（乙腈:0.2%氨水），包括75:25、84:16以及90:10。結(jié)果表明，當水相占比為25%時，可溶性糖的3個組分在8 min內(nèi)全部出峰，但果糖和葡萄糖分離不完全；而當水相占比為10%時，呈現(xiàn)不利效應，組分延遲至22 min才全部出峰，洗脫峰也明顯變寬；84:16的流動相比例顯示結(jié)果理想。在此基礎(chǔ)上，嘗試將氨水濃度調(diào)整為0.1%，結(jié)果顯示其對組分洗脫出峰不利，出現(xiàn)平頂峰和峰型分叉現(xiàn)象。

試驗同時也對比了0.1、0.2、0.3 mL/min等不同流速對組分峰分離的影響。結(jié)果表明，隨著流速的增加，目標組分的出峰時間更短；但當流速大于0.2 mL/min時，柱壓顯著上升，接近儀器設(shè)定的柱壓峰值。對比了25℃及35℃柱溫對3種可溶性糖組分的影響，結(jié)果表明，柱溫升高會縮短目標組分保留時間，樣品峰形變窄，基線更為平穩(wěn)，無目標組分出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，因此最終確定柱溫為35℃。經(jīng)過上述比較，將UPLC-ELSD條件確定為：流動相水相的氨水濃度0.2%，乙腈與氨水的比例84:16，流速0.2 mL/min。柱溫35℃。

將濃度范圍為0.25～2 mg/mL的可溶性糖混標進行UPLC-ELSD分析，結(jié)果顯示，果糖保留時間(RT)為4.3 min，葡萄糖RT為5.4 min，蔗糖RT為9.1 min。根據(jù)峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)得到可溶性糖組分的標準曲線方程（表1）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，3個可溶性糖組分測定的相關(guān)系數(shù)介于0.992和0.997之間，表明所測組分在該范圍內(nèi)保持良好的線性。將樣品可溶性糖提物液進行UPLC-ELSD分析，結(jié)果顯示，樣品中各組分分離行為與標樣一致。

表1 可溶性糖標樣的回歸方程

2.2 UPLC-MS條件建立及有機酸組分分析

將有機酸混標進行UPLC-MS分析，結(jié)果表明，負離子模式下，丙酮酸m/z為87，RT為1.26 min；草酸m/z為89，RT為0.94 min；乳酸m/z為89，RT為1.73 min；富馬酸m/z為115，RT為1.37 min；琥珀酸m/z為117，RT為3.07 min；草酰乙酸m/z為131，RT為1.17 min；蘋果酸m/z為133，RT為1.36 min；酒石酸m/z為149，RT為1.06 min；莽草酸m/z為173，RT為1.47 min；奎尼酸m/z為191，RT為1.14 min；檸檬酸m/z為191，RT為2.37 min。各有機酸組分離子峰型都較好，在4 min內(nèi)全部出峰。將不同的荔枝有機酸粗提物樣品進行UPLC-MS分析，結(jié)果顯示，共檢出草酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸和檸檬酸等8種有機酸，而丙酮酸、乳酸和草酰乙酸等3個組分不能檢出；樣品有機酸各組分的分離行為與標樣一致。

2.3 荔枝果實中的可溶性糖組分

測定結(jié)果（表2）顯示，‘烏葉’和‘蘭竹’發(fā)育期果實果皮可溶性糖組分中蔗糖含量為最高，葡萄糖、果糖含量次之，果皮還原糖總量與蔗糖相當。成熟果果皮可溶性總糖含量上升，果糖積累顯著，含量超過蔗糖；葡萄糖有所增加，而蔗糖含量則略有下降。2個品種表現(xiàn)基本一致。進一步分析還原糖與蔗糖的比值，結(jié)果顯示，兩者還原糖:蔗糖的比例顯著上升，‘烏葉’總體上升接近2倍，‘蘭竹’則上升接近3倍，表明還原糖在成熟荔枝果皮中顯著積累。

表2 ‘烏葉’‘、蘭竹’果實中可溶性糖含量 mg/(g·FW)

對假種皮的分析結(jié)果顯示，發(fā)育期果實果糖、葡萄糖和蔗糖3個可溶性糖組分的含量非常接近。但至果實成熟，品種間差異顯著?！疄跞~’假種皮3個可溶性糖組分均顯著積累；而‘蘭竹’假種皮僅蔗糖含量大幅上升，果糖和葡萄糖則增加很少。進一步分析還原糖與蔗糖的比值發(fā)現(xiàn)，兩者比值均明顯低于1，表明‘烏葉’和‘蘭竹’均為蔗糖積累型果實（表2）。

2.4 荔枝果實中的有機酸組分

果皮有機酸組分的UPLC-MS定量結(jié)果顯示，‘烏葉’和‘蘭竹’荔枝發(fā)育期果實果皮有機酸組分均以莽草酸和奎尼酸為主，兩者合計接近有機酸總量的90%，其次是蘋果酸、富馬酸、檸檬酸和酒石酸。成熟果果皮莽草酸和奎尼酸含量均下降，其中莽草酸下降顯著，總體降幅超過50%，但兩者合計仍占有機酸總量的75%。成熟果實果皮中蘋果酸、富馬酸、檸檬酸和酒石酸含量均有所上升。琥珀酸含量一直很低且基本保持不變，草酸則僅在‘蘭竹’荔枝發(fā)育期果實果皮中有少量檢出?？傮w上，至果實成熟，荔枝果皮有機酸總量明顯下降（表3）。

表3 ‘烏葉’‘、蘭竹’荔枝果皮有機酸含量 mg/(g·FW)

對假種皮的分析結(jié)果顯示，‘烏葉’和‘蘭竹’荔枝均以積累蘋果酸為主，其次是富馬酸，約為蘋果含量的1/2，兩者合計占有機酸總量的90%。至果實成熟，兩者均顯著下降，但仍占有機酸總量的83%。莽草酸和奎尼酸含量在果實發(fā)育初期僅次于蘋果酸和富馬酸，但至果實成熟，均下降到不能檢出。草酸和檸檬酸含量在發(fā)育期果實中緊隨其后，至果實成熟草酸呈明顯上升趨勢，而檸檬酸含量則下降。此外，琥珀酸僅發(fā)現(xiàn)于發(fā)育期果實假種皮，且含量低。與發(fā)育期果實相比，成熟果實假種皮的有機酸總量顯著下降（表4）。

表4 ‘烏葉’‘、蘭竹’荔枝假種皮有機酸含量 mg/(g·FW)

3 討論

3.1 可溶性糖及有機酸UPLC方法的建立

前人研究已指出，與傳統(tǒng)果實糖酸測定方法相比，液相色譜法能更好地應用于果實中糖酸組分的分離和定量分析。已有的研究報道顯示，荔枝果實可溶性糖組分的高效液相色譜(HPLC)柱后大多采用RID進行定量[11,20]；相比較而言，采用ELSD檢測具更高的靈敏度和更好的穩(wěn)定性[5,21-22]。應用HPLC法測定荔枝果實中的有機酸[11,20,23]，容易因組分分離不完全，雜質(zhì)干擾等因素而影響定量；而通過色譜分離結(jié)合MS技術(shù)，可綜合運用保留時間和物質(zhì)組分的離子分析，能更好地保證其定性及定量結(jié)果的準確性[7,24-25]。與HPLC相比，UPLC具消耗少、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點。本研究利用UPLC-ELSD建立了適合荔枝果皮和假種皮可溶性糖的定量檢測方法，利用UPLC-MS建立了適合荔枝果皮和假種皮有機酸的定量檢測方法，結(jié)果顯示，各組分分離行為好，可溶性糖組分在10 min內(nèi)全部出峰，有機酸組分在4 min內(nèi)全部出峰。

3.2 不同發(fā)育階段果實可溶性糖的變化

本研究首次分析了荔枝果皮的可溶性糖組分，發(fā)現(xiàn)在荔枝發(fā)育期果實的果皮中，可溶性糖以蔗糖含量最高，還原糖與蔗糖之比約為1。而至果實成熟，果糖含量顯著上升，還原糖與蔗糖的比例均遠大于1。表明荔枝在成熟過程中果皮蔗糖的降解或轉(zhuǎn)運趨于活躍。而在‘烏葉’和‘蘭竹’荔枝發(fā)育期果實的假種皮中，可溶性糖各組分的含量非常接近，這與前人研究結(jié)果相似[10,26]；但至果實成熟，則是蔗糖含量最高，還原糖與蔗糖的比值均明顯低于1，表明兩者均為蔗糖積累型品種。

3.3 不同發(fā)育階段果實有機酸的變化

本研究首次對荔枝果皮的有機酸組分進行了分析，發(fā)現(xiàn)果皮富含莽草酸和奎尼酸，且占比很高。發(fā)育期果實果皮中莽草酸和奎尼酸約占總有機酸的90%，至果實成熟時含量有所下降，但仍占有機酸總量約75%。莽草酸和奎尼酸可經(jīng)代謝轉(zhuǎn)入苯丙烷次生代謝途徑[27-29]。前人的研究已顯示，荔枝果皮含有豐富的黃烷醇及其寡聚物、花色苷、黃酮類等豐富的多酚類次生代謝物[30-32]。該現(xiàn)象可能暗示莽草酸及其變化與荔枝果皮的多酚類生物合成有關(guān)，而這有待進一步的研究揭示。另外，與發(fā)育期果實相比，成熟果果皮的蘋果酸、富馬酸、檸檬酸等組分均顯著增加?；ㄉ帐抢笾麑嵆墒熘钪饕纳匚镔|(zhì)，其作為一類水溶性色素，主要存在于細胞的液泡[33]。這些有機酸組分的積累是否與花色苷的生物合成及果皮著色有關(guān)，亦待進一步的研究。

Paull等[34]曾報道，成熟荔枝假種皮主要有機酸為琥珀酸。但本研究結(jié)果表明，2個供試品種均以蘋果酸積累為主，琥珀酸僅在發(fā)育期果實假種皮中有少量積累，在成熟果中并未檢出，這與前人[35-36]研究結(jié)果一致。胡志群等[11]利用高效液相色譜發(fā)現(xiàn)荔枝果肉中主要有機酸是蘋果酸和酒石酸，此外還有少量的抗壞血酸和草酸。Somboonkaew等[23]利用高效液相色譜也發(fā)現(xiàn)荔枝果肉中的主要有機酸是蘋果酸，還記錄了低濃度草酸、酒石酸、抗壞血酸和檸檬酸。這些結(jié)果都指向了荔枝果肉主要有機酸為蘋果酸，且有機酸種類和含量依品種和產(chǎn)地的不同而不同。此外，王思威等[7]通過高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對5個荔枝品種的有機酸進行檢測，均檢測到了高濃度的乳酸，且含量僅次于蘋果酸。筆者對發(fā)育期果實和成熟果的分析均未檢出乳酸，只是在采后低氧貯藏的果實中發(fā)現(xiàn)了乳酸的顯著積累（未發(fā)表數(shù)據(jù)），顯示其可能與采后發(fā)酵代謝有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究建立了荔枝果實可溶性糖、有機酸組分的UPLC定量方法，應用該方法首次分析了不同發(fā)育階段果皮糖、酸組分的變化，并與假種皮進行比較后發(fā)現(xiàn)，果皮有機酸組分顯著異于假種皮。且兩者在生長發(fā)育過程中可溶性糖和有機酸組分存在不同的消長變化。