二氧化氯對蝴蝶蘭軟腐病菌的抑殺作用評價——基于病害流行因子

沈會芳，張景欣，楊祁云，蒲小明，孫大元，劉平平，林壁潤

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

細菌性軟腐病是蝴蝶蘭的毀滅性病害，多發(fā)于葉片，受感染后葉片出現(xiàn)水漬狀斑點。高溫下病勢發(fā)展快速，3天可使整葉腐爛，并向其他葉片和根部蔓延，引起全株腐爛死亡。據(jù)統(tǒng)計，自貴陽市引種蝴蝶蘭以來，在夏秋兩季，細菌性軟腐病棚率82.3%、病株率52.7%、病葉率9.4%，給蝴蝶蘭生產(chǎn)造成重大損失[1]。當前，蝴蝶蘭規(guī)模化生產(chǎn)多采用溫室栽培，蝴蝶蘭生長光溫需求相對較高，環(huán)境控制不當容易造成溫度偏高、濕度過大、通風不良等情況，誘發(fā)軟腐病的發(fā)生，因此，明確該病的發(fā)生流行條件，對病害防治有重要意義。浙江[2]、伊犁[3]和臺灣[4]地區(qū)通過傳統(tǒng)病害鑒定與分子生物方法相結(jié)合，將病菌鑒定為菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)，與國外報道的一致[5]。隨著對歐文氏菌研究的深入，該病菌命名產(chǎn)生較大變化，造成一些文獻引用混亂，將同種異名混淆為不同種。菊歐文氏菌先被分類到果膠桿菌屬，病菌被稱為菊果膠桿菌(Pectobacterium chrysanthemi)，后隨著歐文氏菌屬細分為5個屬[6-7]，蝴蝶蘭軟腐病菌被歸為迪基氏屬的Dickeya dieffenbachiae[8]。2018年，Zhang 等[9]對病菌全基因組進行分析，建議將病菌歸為迪基氏屬的新種D.fangzhongdai。該病蔓延速度極快，黃樹欽等報道流行季節(jié)日增發(fā)病株率可達0.3%～0.8%，可迅速造成毀滅性危害[10]。蝴蝶蘭主栽品種對軟腐病菌的抗性較低，防治該病仍以藥劑為主。以前，市場上以抗生素特別是農(nóng)用鏈霉素為主要防治藥劑，2016年最后一個農(nóng)用硫酸鏈霉素登記證件到期，不再續(xù)展，意味著農(nóng)用鏈霉素不再用于植物細菌病害防治，導致軟腐病防治幾乎無藥可用，篩選新藥劑成為當務之急。李艷梅等[11]選取24種對細菌有抑制作用的中草藥，進行單因素與雙因素的抑菌測定，結(jié)果表明烏梅-五倍子提取液1:3混合抑菌效果最好，平均抑菌圈直徑為3.93 cm。尤毅等[12]在室內(nèi)平板培養(yǎng)基上測定13種殺菌劑對病菌的抑菌活性，80%乙蒜素乳油、20%細美葉枯唑可濕性粉劑、50%氯溴異氰尿酸可溶性粉劑、1 g/100萬單位硫酸鏈霉素和1 g/100萬單位四環(huán)素對病原菌具有較強的毒力。沈會芳等[13]采用盆栽試驗、杜啟蘭等[14]應用大棚藥劑試驗，報道氧氯化銅對蝴蝶蘭軟腐病的防治效果達70%以上。銅制劑起保護作用，銅顆?？烧掣皆谌~片表面，將病菌與其侵入傷口等隔開，形成物理保護屏障[15]，一旦病菌侵入葉片內(nèi)部，防治效果明顯下降。因此，從源頭控制病菌傳播才是防治病害的有效手段。針對該病害發(fā)生流行條件尚不明確，缺少阻斷病害傳播的高效消毒劑的現(xiàn)狀，筆者研究病害發(fā)生流行的適宜濕度、溫度和侵染方式，明確病害流行條件，在此基礎上評價消毒劑二氧化氯對病菌的抑殺效果，優(yōu)化其消毒條件，用于農(nóng)事操作中工具的消毒，以阻止病菌的傳播擴散，達到從源頭上控制病害、減少損失的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2019年3月—2020年10月在廣東省植物保護新技術重點實驗室進行。

1.2 試驗材料

蝴蝶蘭細菌性軟腐病菌(D.fangzhongdai)，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所。蝴蝶蘭品種為‘富樂夕陽’。LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.0，121℃滅菌30 min后備用。8%二氧化氯（新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司），50%溴氯海因（山西昌泰動物藥業(yè)有限責任公司），61%三氯異氰脲酸片（運城市華豐生物科技有限公司），20%聚維酮碘（運城市貝爾特生物科技有限公司），高錳酸鉀（分析純，鄭州中天實驗儀器有限公司），20%戊二醛溶液（黑龍江省匯豐動物保健品有限公司）。

1.3 菌懸液制備及蝴蝶蘭葉片采集

將病菌接種于LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)24 h，用LB培養(yǎng)液配成106～107cfu/mL的菌懸液，備用。用消毒剪刀剪取蝴蝶蘭中下部葉片，75%酒精噴霧葉片消毒，備用。

1.4 溫度和濕度對病害侵入和發(fā)展的影響

采用2種方法接種病菌。（1）針刺接種，在葉片上選取2點，每點用無菌大頭針蘸菌液密集輕刺5次；（2）摩擦接種，用砂紙在葉片上摩擦后，將菌液噴霧在葉片上。處理后葉片放入磁盤保濕，溫度設置24、26、28、30、32、34、36℃，恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)；濕度設置60%、70%、80%和90%，人工氣候箱30℃黑暗培養(yǎng)。每處理10片葉，3次重復。24 h后測量病斑直徑，記錄發(fā)病面積，計算病情指數(shù)。

1.5 傷口對病害侵入的影響

（1）選取健康無傷口葉片，用砂紙在葉片上摩擦后，將菌液噴霧在葉片上。以健康葉片直接噴菌液為無傷口接菌對照，以砂紙摩擦后噴無菌水為有傷口無菌對照。噴菌液時注意遮住葉柄處傷口，防止傷口處沾上菌液。30℃保濕培養(yǎng)24 h后記錄發(fā)病面積，計算病情指數(shù)。

（2）取無菌剪刀先剪1片病葉，再用這把剪刀連續(xù)剪去10片健康葉片頂部，同時以剪刀先剪1片健康葉片為對照；30℃保濕培養(yǎng)24 h后，記錄葉片發(fā)病情況，計算發(fā)病率。

1.6 評價二氧化氯對病菌的抑殺作用

1.6.1 不同消毒劑對病菌的生物活性測定 取4.9 mL菌懸液加入無菌試管，加入0.1 mL不同消毒劑溶液，使消毒劑濃度為 1000、500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95、0 μg/mL。每處理3只試管，3次重復，30℃搖床培養(yǎng)，24 h后觀察無細菌生長的最低濃度，即該消毒劑的最小抑菌濃度(MIC)。將LB培養(yǎng)基制成平板，用油性筆均勻分成8份，取上述消毒劑處理后菌液在平板上劃線，30℃培養(yǎng)24 h，無細菌生長最低濃度，即該消毒劑的最小殺菌濃度(MBC)。

1.6.2 掃描電鏡觀察二氧化氯對病菌菌體形態(tài)的影響取4.9 mL菌懸液加入試管，加入0.1 mL二氧化氯溶液，使處理濃度為62.50、125 μg/mL，30℃搖床培養(yǎng)1 h，離心，用LB培養(yǎng)液沖冼菌體3次，離心保留菌體，掃描電鏡處理方法參照文獻[16]。

1.6.3 不同濃度二氧化氯對病菌殺菌時間測定 取4.9 mL菌懸液加入試管，加入0.1 mL二氧化氯溶液，使二氧化氯濃度分別為 1000、500、250、125、62.50、31.25、0 μg/mL，30℃搖床培養(yǎng) 0.5、1、2、4、8、16、32、64 min后，分別用接種環(huán)取處理后菌液在LB平板上劃線，30℃培養(yǎng)24 h后觀察病原菌生長情況。

1.6.4 離體葉片法驗證二氧化氯對病菌的消毒效果 取無菌剪刀，各先剪一次病葉后，分別放入250、500 μg/mL的二氧化氯溶液中浸泡0、0.5、1、2、4、8、16、32、64 min后，取出剪刀連續(xù)剪10片健康葉片，每處理10片葉，3次重復，葉片30℃保濕培養(yǎng)24 h后，記錄葉片發(fā)病情況。

1.7 病害分級調(diào)查標準和病情指數(shù)計算

葉片病情分級調(diào)查標準：0級，葉片無軟腐癥狀；1級，總軟腐病斑面積≤20%葉片面積；2級，20%葉片面積<病斑總面積≤40%葉片面積；3級，40%葉片面積<病斑總面積≤60%葉片面積；4級，60%葉片面積<病斑總面積≤80%葉片面積；5級，病斑總面積>80%葉片面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對病菌侵入和病害發(fā)展的影響

采用摩擦和針刺接種研究環(huán)境因子對病害發(fā)生發(fā)展的影響。摩擦接種時，病菌噴在葉片表面，需侵入才能危害蝴蝶蘭，用于研究環(huán)境因子對病菌侵入的影響；針刺接種時，病菌隨接種針直接進入葉片內(nèi)部，用于研究環(huán)境因子對病害發(fā)展的影響。

不同溫度對蝴蝶蘭軟腐病菌侵入和病害發(fā)展的影響差異明顯。摩擦接種（圖1a和c，圖片均為葉背面）和針刺接種（圖1b和d），24℃時葉片均不發(fā)病；26～36℃葉片可發(fā)病，其中28～32℃適宜病害發(fā)展；溫度為30℃時，摩擦接種的葉片病情指數(shù)和針刺接種的病斑直徑均最大，表明30℃是病菌侵入和病害發(fā)展的最適溫度。

圖1 溫度對蝴蝶蘭細菌性軟腐病菌侵入和病害發(fā)展的影響

2.2 濕度對病菌侵入和病害發(fā)展的影響

摩擦接種葉片（圖2a和c），濕度為60%和70%時葉片不發(fā)病，濕度為80%時葉片上出現(xiàn)病斑，濕度增加到90%時病情指數(shù)明顯加重，因此，高濕利于病菌的侵入。針刺接種時（圖2b和d），不同濕度處理的葉片均明顯發(fā)病，病斑直徑差異不顯著。針刺接種直接把病菌接入葉片內(nèi)，內(nèi)部汁液可為病菌增殖提供足夠濕度，因此，病菌進入葉片內(nèi)部后，外部環(huán)境濕度對病害發(fā)展影響不大。試驗結(jié)果表明，高濕度利于病原菌的侵入，病菌侵入后，病害發(fā)展與環(huán)境濕度相關性不大。

圖2 濕度對蝴蝶蘭細菌性軟腐病菌侵入和病害發(fā)展的影響

2.3 傷口對病菌侵入和病害發(fā)展的影響

摩擦葉片造成傷口后噴病原菌液，24 h后葉片發(fā)病率為100%，而健康葉片噴菌液，葉片全部未發(fā)病，表明病菌需通過傷口才能侵入葉片為害（圖3a）。用先剪健康葉片的剪刀再連續(xù)剪10片健康葉片，所有葉片均未發(fā)?。坏暨^病葉的剪刀再剪10片健康葉片，處理葉片發(fā)病率為100%，在葉片頂端均可見明顯軟腐癥狀（圖3b）。因此，病菌在溫濕度適宜的情況下，極易通過農(nóng)事操作造成的傷口，從病株傳播到健康植株。

圖3 傷口對蝴蝶蘭細菌性軟腐病菌侵入和病害發(fā)展的影響

2.4 評價二氧化氯對病菌的抑殺作用

2.4.1 不同消毒劑對病菌的生物活性測定 病菌需通過傷口侵入葉片為害，且病害在高溫高濕條件發(fā)展迅速，極難防治，因此應用消毒劑對操作工具進行消毒，從源頭上切斷病菌傳播，是預防病害的有效方法。

測定6種消毒劑對病菌的生物活性，消毒劑對病菌的最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果見表1。高錳酸鉀和聚維酮碘對病菌抑菌能力較弱，在1000.00μg/mL時無抑菌作用，三氯異脲酸在500.00μg/mL、溴氯海因和戊二醛在250.00μg/mL時抑制病菌的生長，二氧化氯對病菌的MIC為62.50μg/mL，抑菌效果最好。進一步對二氧化氯的最小殺菌濃度(MBC)進行測定，結(jié)果見圖4，125μg/mL二氧化氯處理病菌時，病菌在LB平板上不生長，表明二氧化氯對病菌的MBC是125μg/mL。

表1 消毒劑對蝴蝶蘭軟腐病菌的生物活性

圖4 二氧化氯對蝴蝶蘭軟腐病菌的最小殺菌濃度測定

2.4.2 二氧化氯對病菌菌體形態(tài)的影響 在掃描電子顯微鏡下，未用二氧化氯處理的對照菌體呈長圓柱形、長橢圓形，菌體飽滿，邊緣光滑（圖5a）。用最小抑菌濃度62.50μg/mL的二氧化氯處理病菌1 h后，大部分病菌表面粗糙，出現(xiàn)皺褶、菌體萎縮（圖5b），部分菌體細胞壁破損，細胞內(nèi)物質(zhì)外漏（圖5c）。用最小殺菌濃度125.00μg/mL的二氧化氯處理后1 h后，菌體細胞壁多處破損，破裂，胞內(nèi)物質(zhì)大量滲漏，菌體嚴重皺縮變形，呈細長條形（圖5d），此時，病菌已被完全殺死。

圖5 二氧化氯對蝴蝶蘭軟腐病菌菌體形態(tài)的影響

2.5 不同濃度二氧化氯對病菌殺菌時間測定

125μg/mL的二氧化氯處理病菌，在32 min時，可以殺滅細菌；濃度增加到250μg/mL，二氧化氯處理2 min可殺滅細菌，當濃度為500μg/mL時，0.5 min就可完全殺滅細菌（表2）。因此，250、500μg/mL的二氧化氯可在較短時間內(nèi)殺滅細菌，是較適合的快速消毒濃度。

表2 二氧化氯不同處理濃度和處理時間對蝴蝶蘭軟腐病菌的殺滅效果

2.6 離體葉片法驗證二氧化氯對病菌的消毒效果

250μg/mL的二氧化氯溶液浸泡帶菌剪刀0.5 min和1 min后，剪健康葉片，葉片平均發(fā)病率分別為16.67%和13.33%，浸泡時間增加到2 min及以上時，處理葉片均未發(fā)?。▓D6a）。用500μg/mL的二氧化氯溶液浸泡帶菌剪刀0.5 min及以上再剪健康葉片，處理葉片均未發(fā)病（圖6b）。表明用500μg/mL二氧化氯浸泡帶菌剪刀0.5 min可完全殺滅病菌，可用于蝴蝶蘭農(nóng)事操作過程中工具的快速消毒，以阻斷病菌傳播。

圖6 二氧化氯對蝴蝶蘭軟腐病菌的消毒效果

3 結(jié)論

蝴蝶蘭細菌性軟腐病在高溫、高濕條件下發(fā)展迅速，28～32℃適宜病菌的侵入和病害發(fā)展，最適溫度為30℃；濕度高于80%利于病菌侵入和發(fā)展；病菌需要通過傷口才能侵入植株內(nèi)部，容易通過農(nóng)事操作造成的傷口從病株傳播到健康植株。二氧化氯對病菌最小抑菌濃度(MIC)為62.5μg/mL，最小殺菌濃度(MBC)為125μg/mL。二氧化氯使病菌菌體萎縮、破裂，胞內(nèi)物質(zhì)外漏致菌體皺縮變形，嚴重時呈細長條形，最終殺死病菌。應用500μg/mL二氧化氯浸泡0.5 min能完全殺死細菌，可用于農(nóng)事工具的快速消毒，以阻止病菌傳播。

4 討論

軟腐病是蝴蝶蘭生產(chǎn)上的重要病害，發(fā)展迅速，危害嚴重，極難防治。本研究表明，28～32℃適宜病菌侵入和病害發(fā)展，最適溫度為30℃；濕度為80%時，葉片出現(xiàn)病斑，濕度增加到90%，病情指數(shù)明顯加重。黃樹欽等觀察發(fā)現(xiàn)溫度超過26℃、濕度超過60%時，大棚蝴蝶蘭植株開始發(fā)病，隨著溫度、濕度的增高，發(fā)病速度逐步加快[10]。刁平芬等[1]報道病菌生長適溫29℃，高溫、高濕、通風不良有利該病的發(fā)生。張敏[17]也認為防治該病害關鍵是嚴格控制濕度，應盡最大程度保持在70%左右，與本研究基本一致。病菌需要通過傷口才能侵入植株，當農(nóng)事操作損傷到葉片，軟腐病菌容易通過工具傳播，如剪除病部組織時不及時對工具進行消毒，接觸其他植株時，病菌會從傷口侵入蝴蝶蘭植株。本研究結(jié)果表明，無論是帶菌剪刀剪傷葉片或是帶菌砂紙摩擦造成傷口，均易將病菌傳播到健康葉片，發(fā)病率高達100%。黃樹欽等[10]強調(diào)避免用山泉水直接澆灌蝴蝶蘭，山泉水含細砂較多，在水流沖擊下，砂粒易造成蝴蝶葉表的傷口，利于傳染病菌。本研究表明，高溫高濕利于蝴蝶蘭軟腐病菌的侵入和病害擴展，一旦病菌侵入，病害發(fā)展迅速。丁銀花等[18]也報道在環(huán)境適宜的情況下，病斑會迅速擴大，2～3天小苗出現(xiàn)死亡，4～5天成株苗死亡，即使使用化學藥劑也極難控制病害蔓延。但病菌需經(jīng)過傷口才能侵入葉片，評價高效消毒劑對病菌的抑殺作用，優(yōu)化其消毒方法，用于操作工具的快速消毒，可在源頭阻斷病菌傳播，有效預防病害，且成本較低。

二氧化氯是世界衛(wèi)生組織向全世界推薦的A級廣譜高效、安全的化學消毒劑，具有較強的氧化作用，對微生物細胞壁有較好的吸附和透過性能，與蛋白質(zhì)中部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應，使氨基酸分解破壞，進而控制微生物蛋白質(zhì)的合成，最后導致微生物死亡，對細菌、病毒、真菌、芽孢均有殺滅作用[19-20]。在細菌性軟腐病防治方面，Mahovic等[21]、Pao等[22]利用二氧化氯防治西紅柿軟腐病(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)。陳遠鳳等[23]報道高于5 mg/L的二氧化氯進行水體消毒可預防香蕉軟腐病(Dickeya zeae)通過水源傳播，對發(fā)病蕉穴土壤的消毒可以使用1500 mg/L二氧化氯處理以達到清除病原的目的。田世龍等[16]報道，離體條件下，近緣種馬鈴薯塊莖軟腐病原菌(Pectobacterium carotovorum)對二氧化氯具有較好的敏感性，EC50和EC90分別為0.2524 μg/mL和0.4872 μg/mL。Tsai等[24]也報道二氧化氯可有效抑制馬鈴薯塊莖軟腐病菌，對病害有較好的效果，且無化學殘留，對人體無害。喬勇進等報道二氧化氯處理能夠破壞大白菜軟腐病菌(Pectobacterium carotovorum)細胞膜滲透性，抑制果膠桿菌的生長繁殖，降低其存活率；還可抑制其纖維素酶、果膠酶等致病酶的活性，降低其致病性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，二氧化氯對病菌最小抑菌濃度(MIC)為62.5μg/mL，最小殺菌濃度(MBC)125μg/mL。125μg/mL的二氧化氯可使蝴蝶蘭軟腐病菌菌體細胞壁破裂，胞內(nèi)物質(zhì)大量滲漏，菌體嚴重皺縮變形為細長條形，最終殺死病菌。500μg/mL二氧化氯在0.5 min內(nèi)能完全殺滅蝴蝶蘭軟腐病菌，可用于農(nóng)事操作中工具的快速消毒，以防止病菌傳播蔓延?？梢姡趸葘m軟腐病菌也有較好的抑殺作用，可用于蝴蝶蘭細菌性軟腐病的防治。

本研究在明確軟腐病發(fā)生流行條件的基礎上，篩選出高效消毒劑二氧化氯，評價其對病菌的抑殺效果，優(yōu)化其消毒條件，為病害提供簡單實用的防治技術，在蝴蝶蘭生產(chǎn)中極具推廣應用價值。但二氧化氯的消毒效果還需要在生產(chǎn)上進行驗證，因此下一步工作將通過田間應用驗證二氧化氯的消毒效果，同時開展二氧化氯對病菌的消毒機理研究。