米曲霉脂肪酶富集濃縮裂殖壺藻油脂中DHA的機(jī)理研究

傅新媛 黃林潔 劉思彤 邵雅婷 王 芳,2 鄧 剛

(浙江省特色經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)研究重點實驗室；浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院1，金華 321004) (浙江師范大學(xué)行知學(xué)院理學(xué)院2，蘭溪 321100)

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)，是一種常見的Omega-3型多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)，通常認(rèn)為它對人的智力及視神經(jīng)的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[1，2]，而被廣泛用于乳制品、營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域，近年來我國DHA的市場規(guī)模不斷擴(kuò)大，總市值已達(dá)到360億元[3]。目前DHA主要來源是魚類和微藻[4，5]，魚油中DHA含量較低，僅為10%左右，而微藻脂質(zhì)中DHA含量因藻種和培養(yǎng)方式而異，最高可達(dá)40%。由于上述原料常含有色素及其他飽和脂肪酸等雜質(zhì)，DHA含量低且在脂質(zhì)中存在形式呈現(xiàn)多樣化，導(dǎo)致產(chǎn)品具有異味、易酸敗等問題，因此對油脂進(jìn)行提純除雜，獲取高純度、甘三酯型DHA產(chǎn)品，不僅可以提高產(chǎn)品品質(zhì)，增加附加值，而且將極大地提高DHA類產(chǎn)品的穩(wěn)定性，延長貨架期。因而，隨著國內(nèi)外對高濃度PUFAs的需求持續(xù)增加，富集濃縮天然油脂中DHA的研究已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注。

傳統(tǒng)的DHA富集濃縮方法有尿素包合法[8，9]、低溫結(jié)晶法[10，11]等。尿素包合法是尿素在體系中能包合短鏈飽和脂肪酸，而不能包合長鏈的不飽和脂肪酸，構(gòu)象復(fù)雜的DHA多被富集在溶液中[12]。低溫結(jié)晶法是低溫條件下，由于脂肪酸分子量存在差異，因而結(jié)晶能力有所不同，分子量大、不飽和程度高的DHA在溶劑中不易結(jié)晶，被富集在清液中[13]。以上兩種方法選擇性較低，且需要大量使用有機(jī)溶劑，隨著國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實施，需要開發(fā)環(huán)境友好型的工藝取代傳統(tǒng)老舊工藝迫在眉睫，近年來各類酶法濃縮DHA新工藝，因其條件溫和、能效率高等優(yōu)點正逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，部分脂肪酶對底物甘三酯甘油骨架上酯鍵的水解具有區(qū)域選擇性(Regioselectivity)，Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自淺紫鏈霉菌(Streptomycesviolascen)的脂肪酶僅能水解鱈魚肝油甘三酯甘油骨架sn-1,3位上的酯鍵，使得sn-2位上的脂肪酸被保留，DHA能在單甘脂和甘二酯中被富集。另一類是脂肪酶對底物甘油三酯甘油骨架上相連的脂肪酸水解具有選擇性(Acyl Chain Specificity)，Chen等[15]采用脂肪酶法對鱈魚肝油進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)皺褶假絲酵母脂肪酶(CandidarugosaLipase)對骨架上短鏈脂肪酸(C18或以下)表現(xiàn)出特異性選擇，會優(yōu)先水解飽和和單不飽和脂肪酸，最后水解PUFAs，使得DHA能在甘油酯中富集。由此可見，采用脂肪酶法富集濃縮DHA主要是依賴于脂肪酶對底物水解的特異性選擇，除了篩選價格低廉、催化效率高的脂肪酶，更重要的是必須深入了解各類脂肪酶催化反應(yīng)機(jī)制，探究富集濃縮DHA的原理，為實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。本次研究采用產(chǎn)自米曲霉(Aspergillusoryzae, AO)的游離脂肪酶對裂殖壺藻油脂進(jìn)行水解，經(jīng)薄層層析法分離回收了酶解產(chǎn)物中脂質(zhì)，并結(jié)合氣相色譜對各脂質(zhì)中脂肪酸組成及DHA含量進(jìn)行了分析，通過核磁共振碳譜(13C-NMR)進(jìn)一步考察酶解產(chǎn)物中甘三酯甘油骨架上脂肪酸的位置分布，從而闡明了AO脂肪酶催化水解反應(yīng)機(jī)制及富集DHA的原理。

1 材料與方法

1.1 材料

裂殖壺藻油，以裂殖壺藻(Schizochytrium sp.)為菌株發(fā)酵后提取所得，DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35.1%。AO脂肪酶產(chǎn)自米曲霉(Aspergillus oryzae)，酶活力300 000 U/g。

1.2 試劑與儀器

氘代氯仿(CDCl3, 氘代度99.8%+0.03%TMS)；異辛烷為色譜純；二氯甲烷、正己烷、乙醇等試劑均為分析純。7820A氣相色譜儀，AVANCE III 600MHz核磁共振譜儀，BSA224S電子天平，ZWY-2102C恒溫?fù)u床。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶水解裂殖壺藻油脂

脂肪酶水解實驗采用多批次反應(yīng)，批次間相隔4 h，每批次對應(yīng)一個反應(yīng)時間，設(shè)置2個重復(fù)的實驗組和1個對照組。在每組實驗中，100 mL錐形瓶中加入10.0 g裂殖壺藻油脂、10.0 mL 0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液，混合均勻，實驗組加入0.2 g AO脂肪酶，對照組則加入相同量的已滅活的酶，充入氮氣，封口后置于40 ℃、130 r/min恒溫?fù)u床上進(jìn)行反應(yīng)。

1.3.2 薄層層析法分離酶解產(chǎn)物中脂質(zhì)

反應(yīng)進(jìn)行到設(shè)定時間后，分別取出該批次實驗組和對照組的錐形瓶，放入沸水浴5 min，滅酶，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取出上清液，采用GF254型硅膠板(中國青島海洋化工有限公司)進(jìn)行薄層層析(Thin Layer Chromatography, TLC)，甘油酯混合標(biāo)準(zhǔn)品為三油酸甘油酯(97%, 中國卡爾瑪實驗科技有限公司)。分別取10.0 mg和60.0 mg待測液溶于二氯甲烷中，對5 cm×7 cm小板和20 cm×10 cm大板進(jìn)行點樣，展開劑為正己烷-無水乙醚-冰乙酸(70∶30∶0.5)，層析完成后冷風(fēng)吹干，碘蒸汽顯色，小板用于脂質(zhì)組成分析，大板則進(jìn)一步刮下顯色條帶，分別置于10 mL離心管中，用5 mL二氯甲烷超聲浸提各條帶粉末2～3次，合并上清液，氮吹脫除溶劑后，準(zhǔn)確稱量各條帶中脂質(zhì)質(zhì)量，計算脂質(zhì)回收率。

1.3.3 氣相色譜測定脂質(zhì)中DHA含量及脂肪酸組成分析

稱取60.0 mg上述回收得到的脂質(zhì)樣品，溶于4.0 mL異辛烷，加入200 μL 2 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，反應(yīng)10 min，繼續(xù)加入1.0 g硫酸氫鈉，震蕩混勻，靜置分層后，上清液移至樣品瓶中。采用氣相色譜進(jìn)行脂肪酸組成分析，并采用外標(biāo)法[16]測定了各脂質(zhì)中DHA的含量，色譜條件如下：毛細(xì)管色譜柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，載氣為N2(純度>99.99%)，流速1 mL/min。樣品進(jìn)樣量為1 μL，分流比為1∶100，進(jìn)樣口和檢測器溫度分別設(shè)定為270 ℃和280 ℃。采用升溫程序：初始柱溫為100 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升溫至180 ℃，保持6 min；繼續(xù)以1 ℃/min升溫至200 ℃，保持20 min；再以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持10.5 min。

1.3.4 核磁共振技術(shù)分析甘油三酯的甘油骨架上脂肪酸分布

核磁共振碳譜(Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectrum,13C-NMR)分析酶解產(chǎn)物中甘油三酯的甘油骨架上脂肪酸分布。取50 mg TLC法分離回收得到的甘三酯到樣品瓶中，加入0.6 mL氘代氯仿溶解，轉(zhuǎn)移至核磁管中用于分析。13C-NMR條件：譜寬為36 057.69 Hz，90°脈沖寬度為12.0 ms，弛豫時間為2 s，采樣點數(shù)為65536，掃描次數(shù)為200，空掃為4。碳譜的化學(xué)位移以四甲基硅烷(TMS)為標(biāo)準(zhǔn)校正，并利用MestReNova軟件對圖譜進(jìn)行處理并分析[17，18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物和不同反應(yīng)時刻的產(chǎn)物脂質(zhì)分離及組成分析

圖1 底物及不同反應(yīng)時刻產(chǎn)物的脂質(zhì)分離及組成分析

圖2 AO脂肪酶催化水解甘油三酯的反應(yīng)過程

裂殖壺藻油脂經(jīng)AO脂肪酶催化進(jìn)行了水解反應(yīng)，采用薄層層析法對底物S和不同反應(yīng)時刻的產(chǎn)物P1-P5進(jìn)行了脂質(zhì)分離及組成分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，裂殖壺藻油脂作為底物，主要由甘油三酯(Triglyceride, TAG)和甘油二酯(Diglyceride, DAG)組成，隨著反應(yīng)進(jìn)行，TAG首先被水解生成DAG，進(jìn)而生成單甘脂(Monoglyceride, MAG)，釋放游離脂肪酸(Free fatty acid, FFA)，其反應(yīng)機(jī)理如圖2所示。該水解反應(yīng)共持續(xù)了16 h，間隔4 h取樣進(jìn)行TLC分析，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，TAG的樣點逐漸變小，顏色變淺，而DAG樣點則逐漸變大，顏色加深，并且可觀測到新產(chǎn)生的MAG和FFA的樣點，結(jié)果表明通過TLC脂質(zhì)分析，不僅可以判斷酶解反應(yīng)是否正常，而且可以監(jiān)測反應(yīng)過程中產(chǎn)物中的脂質(zhì)組成變化，但尚不能明確各脂肪酸在脂質(zhì)中分布情況。

2.2 脂肪酶水解裂殖壺藻油脂反應(yīng)動力學(xué)分析

采用TLC法對不同反應(yīng)時間下酶解產(chǎn)物中脂質(zhì)進(jìn)行分離并回收，精確稱量了各脂質(zhì)的質(zhì)量，通過氣相色譜法測定了各脂質(zhì)中DHA的含量，與對照組進(jìn)行了比較，結(jié)果如表1所示。反應(yīng)前60 mg底物共回收得到47.2 mg TAG和7.3 mg DAG，未檢測到MAG和FFA的存在。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，與對照組相比，產(chǎn)物中TAG含量逐漸下降，DAG含量則顯著增加，并且產(chǎn)物中出現(xiàn)了MAG和FFA，同時TAG中DHA含量逐漸升高，反應(yīng)12 h后，TAG總轉(zhuǎn)化率達(dá)47.7%，TAG中的DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至55.43%。

表1 酶解反應(yīng)產(chǎn)物中脂質(zhì)的回收率及各脂質(zhì)中DHA的含量變化

圖3 藻油水解的反應(yīng)動力學(xué)曲線

圖4 甘三酯中DHA含量測定及回收率計算

該酶解反應(yīng)底物TAG轉(zhuǎn)化為DAG、MAG和FFA三類產(chǎn)物，根據(jù)表1計算了回收率，考察了底物的水解量和產(chǎn)物的生成量隨時間的變化，如圖3所示。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，TAG的含量不斷下降，產(chǎn)物DAG、MAG與FFA的總含量逐漸升高。當(dāng)酶解時間為12 h時，反應(yīng)趨于平衡，表明TAG不再向DAG、MAG和FFA轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步測定了不同反應(yīng)時刻酶解產(chǎn)物中TAG內(nèi)DHA的含量并計算了回收率，結(jié)果如圖4所示。反應(yīng)前，底物中TAG內(nèi)DHA含量僅為35.1%，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，DHA含量不斷升高，當(dāng)酶解時間為12 h時，DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.4%，濃縮了1.58倍，回收率高達(dá)68.2%。但是，反應(yīng)12 h之后，TAG中DHA的含量和回收率均呈現(xiàn)下降趨勢。因此，控制AO脂肪酶催化藻油的反應(yīng)時間，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時，DHA可以被富集在甘油三酯中。

2.3 產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸組成及含量分析

采用氣相色譜法進(jìn)一步測定了酶解產(chǎn)物中TAG脂肪酸含量及組成，結(jié)果如表2與圖5所示。

由表2可知，酶解產(chǎn)物中TAG除了含有目標(biāo)物DHA以外，還含有三種飽和脂肪酸(Saturated Fatty Acids, SFAs)，分別為十五酸、棕櫚酸、十七烷酸，一種單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acids, MUFAs)油酸以及其他四種不飽和脂肪酸，分別為亞油酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸。

由圖5可知，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，TAG中DHA含量顯著升高，而SFAs的含量則不斷降低，其他不飽和脂肪酸含量則基本不變。反應(yīng)至12小時，產(chǎn)物TAG中的DHA含量達(dá)到最大值，繼續(xù)反應(yīng)甘油骨架上的DHA將被緩慢水解。在酶解過程中，大分子多不飽和脂肪酸DHA不易被脂肪酸酶AO水解，更傾向于留在TAG甘油骨架上，而其他的小分子脂肪酸則更易被水解，從而造成了DHA在產(chǎn)物TAG中被富集。圖6為二十二碳六烯酸甘三酯化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖，由圖6可知，長碳鏈的DHA易對酯鍵形成包裹效應(yīng)，形成較大的空間位阻，導(dǎo)致酶的活性中心不易靠近酯鍵，極大降低了該類型酯鍵的水解反應(yīng)的速率。

表2 酶解產(chǎn)物甘三酯中的脂肪酸組成分析

圖5 酶解過程中產(chǎn)物甘油三酯各脂肪酸含量的變化

圖6 二十二碳六烯酸甘三酯化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.4 核磁共振分析TAG甘油骨架上脂肪酸分布

為了進(jìn)一步探究酶解過程中DHA相比于其他脂肪酸傾向于保留在TAG甘油骨架上的原因，采用13C NMR考察了酶解產(chǎn)物TAG上的DHA及其他脂肪酸在甘油骨架不同位點上的含量分布，如圖7所示。Ⅰ-Ⅴ區(qū)域分別是脂肪酸羰基碳、脂肪酸烯烴碳、氘代氯仿的碳原子、甘油骨架內(nèi)部碳以及甘油骨架上羰基相連的亞甲基和脂肪酸末端甲基碳原子。對不同酶解反應(yīng)時刻的產(chǎn)物中TAG的脂肪酸羰基區(qū)域(Ⅰ區(qū)域)進(jìn)行比較分析，由圖7可知，TAG甘油骨架sn-1(3)位上SFAs含量隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行不斷下降，DHA含量則逐漸升高；而甘油骨架sn-2位上主要是DHA，其含量在反應(yīng)過程中保持不變；甘油骨架sn-1(3)和sn-2位上MUFAs由于占比過低，變化難以觀測。當(dāng)反應(yīng)12 h后，雖然甘油骨架sn-1(3)位上SFAs已完全水解，但sn-1(3)和sn-2位上的DHA含量也開始下降，說明酶解反應(yīng)時間過長也會導(dǎo)致甘油骨架上的DHA緩慢水解。

圖7 13C-NMR分析酶解產(chǎn)物中TAG甘油骨架上的脂肪酸分布

3 結(jié)論

脂肪酶法富集不飽和脂肪酸工藝往往具有條件溫和、成本低廉等優(yōu)勢，但最終形成實用高效的生產(chǎn)工藝必須對酶催化反應(yīng)原理進(jìn)行深入的了解。本研究表明AO脂肪酶在水解法裂殖壺藻油脂過程中，DHA主要富集在產(chǎn)物甘三酯中，反應(yīng)12 h后，DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.43%，濃縮了1.58倍。經(jīng)氣相色譜結(jié)合核磁共振碳譜(13C-NMR)分析，在AO脂肪酶催化反應(yīng)過程中，甘三酯甘油骨架上的DHA由于位阻效應(yīng)而不易被水解，即酶對不同種類脂肪酸的水解具有選擇性，結(jié)合后繼分子蒸餾、柱層析等方法對甘三脂進(jìn)行分離，有望開發(fā)形成一整套高效經(jīng)濟(jì)的DHA濃縮工藝。