親水性色譜測(cè)定大黃魚(yú)中ATP及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的研究

◎ 方周吉，張茹茹，余永康，蔡瑞鑫，張慧恩

（浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

新鮮度是評(píng)判水產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)，目前新鮮度的評(píng)價(jià)方法通常有感官評(píng)定法、微生物評(píng)價(jià)法、化學(xué)分析法等。各方法之間，評(píng)價(jià)結(jié)果差異較大。2014年原農(nóng)業(yè)部發(fā)布了魚(yú)類鮮度指標(biāo)K值測(cè)定的水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3048—2014，K值指標(biāo)是目前衡量魚(yú)類鮮度最常用的指標(biāo)[1]。K值是以魚(yú)體內(nèi)核苷酸分解過(guò)程中產(chǎn)生的多種次級(jí)產(chǎn)物含量變化情況作為鮮度的判斷依據(jù)?；铙w魚(yú)類肌肉中含有大量三磷酸腺苷（ATP），魚(yú)死后體內(nèi)所含的ATP在酶和微生物的共同作用下發(fā)生分解，依次會(huì)產(chǎn)生二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、次黃嘌呤核苷（HxR）和次黃嘌呤（Hx）。K值是指次級(jí)產(chǎn)物中的次黃嘌呤核苷（HxR）、次黃嘌呤（Hx）量之和與ATP及次級(jí)產(chǎn)物總量的比值。K值的大小能反映核苷酸類物質(zhì)在魚(yú)體內(nèi)的分解程度，是魚(yú)類鮮度評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，一般認(rèn)為K值在20%以下的魚(yú)為鮮度良好。測(cè)定K值需要將魚(yú)體中6種核苷酸及次級(jí)代謝產(chǎn)物都測(cè)定出來(lái)。目前，K值的測(cè)定方法主要有離子色譜法、電泳法、反相液相色譜法等。其中最常用的是反相液相色譜法，反相高效液相色譜法具有操作簡(jiǎn)單、儀器普及率高等優(yōu)點(diǎn)，水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3048—2014魚(yú)類鮮度指標(biāo)K值的測(cè)定就是用反相高效液相色譜法測(cè)定K值。但是，傳統(tǒng)的反相高效液相色譜法分離ATP及次級(jí)產(chǎn)物時(shí)，各組分之間的分離度較低，這是因?yàn)锳TP及次級(jí)產(chǎn)物極性較大，在反相色譜柱上很難保留，分析時(shí)要在高水相條件下進(jìn)行分析，這使得色譜柱對(duì)各組分缺乏了選擇性，達(dá)不到完全分離的效果。而親水性色譜（HILIC）是一種用來(lái)提高強(qiáng)極性物質(zhì)在色譜柱上保留的技術(shù)。它采用特殊的強(qiáng)極性固定相，結(jié)合高比例有機(jī)相來(lái)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)極性物質(zhì)的分離分析，親水性色譜適用于分離測(cè)定強(qiáng)極性化合物[2-7]。

大黃魚(yú)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類，養(yǎng)殖產(chǎn)量居我國(guó)海水養(yǎng)殖魚(yú)類首位。大黃魚(yú)以其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、蛋白質(zhì)高、膽固醇低而著稱。大黃魚(yú)捕撈出水，基本已死亡，市場(chǎng)上大都以冰鮮銷售，新鮮度很難以感官評(píng)價(jià)進(jìn)行判斷。因此，測(cè)定冰鮮大黃魚(yú)魚(yú)肉中的核苷酸及多種次級(jí)產(chǎn)物，以K值為指標(biāo)評(píng)價(jià)大黃魚(yú)的新鮮度是非常必要的[8]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters 2695液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，配置二極管陣列檢測(cè)器）、JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝）、5810R離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、FE28 pH計(jì)（梅特勒）及高速組DS-1織搗碎儀（偉嘉儀器）。

1.2 材料與試劑

大黃魚(yú)：購(gòu)于寧波水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，冰塊保藏，2 h內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP，購(gòu)自源葉生物；乙腈為Fisher色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸、氫氧化鉀為國(guó)藥集團(tuán)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

取魚(yú)背脊上的魚(yú)肉去皮去骨后，均質(zhì)，稱取5.00 g，放入50 mL離心管中，加入預(yù)冷的高氯酸溶液（10%）20 mL，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)提取10 min。8 000 r·min-1，4 ℃離心20 min，取出上清液。再用10 mL高氯酸溶液（10%）提取沉淀物，離心，合并上清液，用KOH溶液調(diào)pH至6.5，用流動(dòng)相定容至50 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待上機(jī)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

用流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP每種標(biāo)樣的濃度梯度為5.0 μmol·L-1、10.0 μmol·L-1、20.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1、100.0 μmol·L-1和200.0 μmol·L-1，進(jìn)樣量20 μL，上機(jī)測(cè)定，以峰面積與濃度作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.3 色譜條件

親水性色譜柱：BEH Amide（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 2.0 mmol·L-1磷酸二氫鉀，B乙腈；洗脫方式：等度洗脫，A 20%，B 80%；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。以組分保留時(shí)間定性，以峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的確定，以不同濃度磷酸二氫鉀溶液（0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、3.0 mmol·L-1、5.0 mmol·L-1）作為流動(dòng)相，測(cè)定ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP的分離情況。磷酸二氫鉀的濃度主要影響流動(dòng)相的pH值，分析物的解離程度受流動(dòng)相pH影響很大，在色譜分析過(guò)程中，只有當(dāng)ATP等物質(zhì)以分子形式存在時(shí)，才能在色譜分離中得到較好的峰形和分離情況。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)磷酸二氫鉀濃度在2.0 mmol·L-1時(shí)能夠使ATP等物質(zhì)解離抑制，大部分以分子形式存在。在親水性色譜中，流動(dòng)相中水相比例越高，洗脫能力越強(qiáng)，這與傳統(tǒng)反相色譜剛好相反，流動(dòng)相中含有大量的有機(jī)相，使親水性色譜的選擇性提高。實(shí)驗(yàn)表明，水相比例在20%時(shí)，各物質(zhì)之間能夠得到較好的分離。因此，流動(dòng)相的組成選擇為2.0 mmol·L-1磷酸二氫鉀∶乙腈為20∶80。ATP、ADP、AMP、Hx、HxR和IMP保留時(shí)間分別為14.73 min、12.71 min、10.89 min、6.21 min、7.62 min和11.63 min。親水性色譜與標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3048—2014中反相色譜的出峰順序不同，各物質(zhì)分離度提高[1]。

2.2 線性回歸、檢出限及定量限

實(shí)驗(yàn)對(duì)6種化合物進(jìn)行外標(biāo)法定量，制作回歸曲線，得到相關(guān)系數(shù)。以6種化合物的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并確定方法檢出限（S/N）＞3和定量限（S/N）＞10，結(jié)果見(jiàn)表1。可知6種物質(zhì)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。

表1 回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限表

圖1 標(biāo)樣色譜圖

圖2 大黃魚(yú)樣品色譜圖

2.3 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)品加入到5.00 g樣品中，配制成高2.0 μmol·g-1、中0.5 μmol·g-1、低0.2 μmol·g-1的3個(gè)濃度加標(biāo)量，進(jìn)行樣品提取和色譜分析，每個(gè)加標(biāo)量做3個(gè)平行，計(jì)算回收率。由表2可見(jiàn)，本方法對(duì)6種化合物的回收率均在90.2%～106.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%～4.2%，重現(xiàn)性和精密度較好。

表2 加標(biāo)回收率和精密度表（n=3）

（續(xù)表2）

3 結(jié)論

對(duì)水產(chǎn)品中ATP及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的測(cè)定，現(xiàn)行有效的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3048—2014采用反相色譜分析法，使用純水相作為流動(dòng)相，各物質(zhì)之間很難完全分離。本研究利用親水性色譜對(duì)ATP及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行分析，親水性色譜使用較高含量的有機(jī)相作為流動(dòng)相，使色譜柱對(duì)各物質(zhì)的保留特性有較大的差異，使各物質(zhì)得到較好的分離，得到較好的效果。此方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、回收率高、精確度高。