大豆低聚糖儀器檢測(cè)方法現(xiàn)狀概述

◎ 劉曉丹，岳海艷，譚智峰

（上海城建職業(yè)學(xué)院 健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院，上海 201415）

大豆低聚糖（Soybean Oligosaccharides，SBOS）是大豆中可溶性寡糖的總稱，主要由2～10個(gè)相同的或不同的單糖以支鏈的形式經(jīng)糖苷鍵聚合而成[1]，其主要成分是蔗糖、棉子糖和水蘇糖[2]，其中蔗糖是由一分子果糖和1分子α-D-吡喃葡萄糖的半縮醛羥基和1分子β-D-呋喃果糖的半縮醛羥基脫水通過1，2-糖苷鍵結(jié)合而成；棉子糖又稱蜜三糖，由右旋半乳糖、右旋葡萄糖和左旋果糖各1分子組成的三糖，即α-D-吡喃半乳糖基-（1,6）-α-D-吡喃葡萄糖基-（1,2）-β-D-呋喃果糖苷；水蘇糖是在蔗糖分子的葡萄糖基上以α-1,6鍵連接2個(gè)半乳糖分子，D-吡喃半乳糖基通過α-1,6糖苷鍵與棉子糖的D-吡喃半乳糖基連接而成的四糖，即由2分子D-半乳糖與1分子蔗糖，通過α-1,6糖苷鍵組成的寡糖，上述3種低聚糖均屬于非還原糖。大豆低聚糖熱穩(wěn)定性較好，在pH=3下也能體現(xiàn)良好的熱穩(wěn)定性。此外，大豆低聚糖中3種主要成分為非還原糖，因此在酸性條件下不易發(fā)生美拉德反應(yīng)，但在中性或堿性條件下溫度超過80 ℃時(shí)，會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)[3]，此外也有研究者嘗試在堿性條件下將殼聚糖與大豆分離蛋白進(jìn)行美拉德反應(yīng)，其褐變程度比較小，褐變程度與糖類分子鏈的長(zhǎng)度有關(guān)[4]，因此，也可以推斷在中性或堿性條件下葡萄糖與大豆分離蛋白褐變程度大于大豆低聚糖褐變程度大于和殼聚糖褐變程度。

大豆低聚糖已公認(rèn)的優(yōu)點(diǎn)是能活化腸道內(nèi)雙歧桿菌并促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖，抑制腸內(nèi)腐敗菌的生成，能預(yù)防便秘和腹瀉，同時(shí)也不會(huì)導(dǎo)致齲齒等；最新研究還表明大豆低聚糖具有降血脂作用，CHEN[5]研究證明大豆低聚糖對(duì)血脂、血糖和氧化應(yīng)激有顯著的降低作用，李倩倩等人[6]研究也證實(shí)了大豆低聚糖對(duì)降低血脂具有有效作用；大豆低聚糖促生長(zhǎng)的腸道益生菌能吸收膽固醇從而有效降低人體血液中膽固醇的含量[7]；大豆低聚糖對(duì)心臟還有保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)在心肌缺血/再灌注過程中，大豆低聚糖預(yù)處理有可能通過激活JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路途徑而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用[8]；大豆低聚糖也被證明抗癌作用，如針對(duì)胃癌，大豆低聚糖可誘導(dǎo)部分胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞凋亡[9]，此外腸道益生菌能降解致癌有害物質(zhì)從而達(dá)到預(yù)防癌癥的作用。誠(chéng)然，大豆低聚糖的缺點(diǎn)也是顯而易見，難于消化，容易形成脹氣因子導(dǎo)致人體不適，但總體而言，大豆低聚糖的優(yōu)點(diǎn)大大高于缺點(diǎn)，成為目前食品界較為關(guān)注的益生營(yíng)養(yǎng)成分，并且很多研究都證實(shí)了大豆低聚糖對(duì)人體的積極功效。

大豆低聚糖中的主要成分蔗糖、棉子糖和水蘇糖是極易溶于水的，因此在大豆制品生產(chǎn)領(lǐng)域，大豆低聚糖往往更多存在于生產(chǎn)廢水——黃漿水中。黃漿水是豆制品加工過程中產(chǎn)生的工業(yè)廢水，在豆腐、千張、豆干等豆制品制作過程中為了使產(chǎn)品固定成型，需要將多余的水和能透過包布的小顆粒及水溶物過濾排出，此過程中通過壓榨擠壓排出的乳黃色或乳白色等均勻不透明的水，稱為“黃漿水”，又叫豆清水[10]。大豆低聚糖在黃漿水中的含量相對(duì)較高，大量排放到環(huán)境中，會(huì)造成大量微生物滋生，造成腐敗導(dǎo)致環(huán)境污染。因此，尋找合理的提取和檢測(cè)大豆低聚糖的方法意義巨大。目前，對(duì)黃漿水中大豆低聚糖分離純化主要流程為脫色去除水溶性蛋白、鹽分、有機(jī)酸等其他雜質(zhì)[11]，其中去除非糖物質(zhì)方法主要有膜分離法[12]和微生物發(fā)酵法[13]，其能耗小，是目前公認(rèn)較為高效經(jīng)濟(jì)的方法。大豆低聚糖的檢測(cè)方法研究較多，但許多第三方檢測(cè)企業(yè)按照國(guó)標(biāo)方法試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基線穩(wěn)定性較差，數(shù)據(jù)精密度、重復(fù)率和回收率均不理想[14]，因此尋找一種有效穩(wěn)定的檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。

1 儀器檢測(cè)檢測(cè)方法

1.1 高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法

大豆低聚糖的檢測(cè)目前使用較為廣泛是按照GB/T 22491—2008附錄A中的高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法（HPLC-FID），采用反相鍵合相色譜。自2008年國(guó)標(biāo)頒布以來，諸多文獻(xiàn)都對(duì)此方法進(jìn)行了相應(yīng)的改進(jìn)，表1是4種文獻(xiàn)方法與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)條件及結(jié)果的比較。

表1 不同年代文獻(xiàn)中高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器檢測(cè)大豆低聚糖的比較表

表1 中文獻(xiàn)方法的檢測(cè)條件都是基于國(guó)標(biāo)方法的優(yōu)化，可以發(fā)現(xiàn)在2014年后，優(yōu)化后的方法檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)隨著流動(dòng)相乙腈的比重變大而變小，檢測(cè)的精密度和回收率也有較好的表現(xiàn)，且基線穩(wěn)定。圖1、圖2分別為2010年文獻(xiàn)法與2014年文獻(xiàn)法的色譜圖，可明顯看出圖譜的基線變平穩(wěn)，分離效果變好，檢測(cè)時(shí)間變短。

圖1 大豆低聚糖2010年文獻(xiàn)法的HPLC色譜圖

圖2 大豆低聚糖2014年文獻(xiàn)法的HPLC色譜圖

對(duì)于國(guó)標(biāo)方法的改進(jìn)研究還在繼續(xù)進(jìn)行，通過更換流動(dòng)相試劑、比例以及檢測(cè)器、色譜柱來提高檢測(cè)效果。但是國(guó)標(biāo)方法對(duì)于樣品前處理需要進(jìn)行衍生，且部分衍生劑只能作用于還原糖，同時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物會(huì)干擾檢測(cè)，因此，國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)低聚糖并非最好方法。鄧樹等人[19]對(duì)貓豆中低聚糖檢測(cè)，使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器低聚糖，在濃度0.04～0.4 mg·mL-1與峰面積線性良好，蔗糖RSD=1.2%、棉籽糖RSD=0.8%、水蘇糖RSD=1.0%，但是蒸發(fā)光散射檢測(cè)器線性范圍較小，相對(duì)于示差折射檢測(cè)器，適用性稍弱，因此后者應(yīng)用較廣泛。

1.2 離子色譜-脈沖安倍檢測(cè)法

對(duì)于食品類樣品進(jìn)行低聚糖檢測(cè)，為了避免樣品衍生法前處理，離子色譜-脈沖安倍檢測(cè)法（HPAECPAD）可作為一項(xiàng)較為可靠的檢測(cè)低聚糖的方法。安培檢測(cè)是一種電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是用于測(cè)量電活性物質(zhì)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生電流變化的檢測(cè)器，其主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)范圍寬及結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。糖類檢測(cè)一般使用脈沖安培檢測(cè)法（PAD），糖類化合物的pKa值為12～14，在強(qiáng)堿性介質(zhì)中以陰離子形式存在，可以用陰離子交換色譜分離。脈沖安倍檢測(cè)器的參比電極一般使用Ag/AgCl電極，工作電極為金電極，原因是金電極的表面可為糖的電化學(xué)氧化反應(yīng)提供反應(yīng)環(huán)境且不需要衍生反應(yīng)和復(fù)雜的樣品純化過程。基于糖的以上兩方面的特性，發(fā)展了一種對(duì)糖的選擇性好而且靈敏度高的色譜分析方法：高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD）[20]。目前使用陰離子色譜-脈沖安倍檢測(cè)法使用的設(shè)備主要為ICS-5000離子色譜儀，國(guó)內(nèi)研究者主要是對(duì)酸奶[21]和嬰幼兒配方奶粉[22-23]中大豆低聚糖（蔗糖、棉子糖和水蘇糖）進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)條件結(jié)果比較見表2。

從表2及對(duì)應(yīng)圖3～5中數(shù)據(jù)可知，文獻(xiàn)A的數(shù)據(jù)較好，文獻(xiàn)B優(yōu)于文獻(xiàn)C，文獻(xiàn)A樣品中成分較少5種，因此用等梯度洗脫就能形成很好的分離，但是對(duì)于文獻(xiàn)B方法就有8種成分，文獻(xiàn)C有13種成分，隨著成分增加分離越困難，RSD也就越大，需采用梯度洗脫。同時(shí)，從圖3、圖4也可以明顯發(fā)現(xiàn)，隨著成分增多，基線的平穩(wěn)性也會(huì)變差。色譜柱CarboPac PA1與CarboPac PA20也進(jìn)行了比較，對(duì)于較多成分的分離，優(yōu)選PA20，PA1會(huì)對(duì)大分子糖產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，保留時(shí)間延長(zhǎng)，分離效果劣于PA20。

圖3 酸奶中低聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖

圖4 嬰幼兒配方奶粉標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜

表2 不同文獻(xiàn)中離子色譜-脈沖安倍檢測(cè)大豆低聚糖的比較表

圖5 嬰幼兒配方奶粉標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜

此外，國(guó)外研究者KOTHA等人[24]運(yùn)用離子色譜-脈沖安倍檢測(cè)法將23種干豆中的7種可溶性糖（葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖）進(jìn)行了分離測(cè)定，在0.156～20 μg·mL-1顯示出很好的線性（r2≥0.99）。由表1和表2 HPAEC-PAD檢測(cè)法與HPLC-FID方法線性范圍數(shù)據(jù)對(duì)比可知，HPAEC-PAD方法線性范圍約在0.1～100.0 mg·L-1，而HPLC-FID方法線性范圍約在0.1～20.0 mg·mL-1，HPAEC-PAD可檢測(cè)更低濃度的低聚糖，且無需衍生反應(yīng)和復(fù)雜的樣品純化過程；而HPLC-FID中通過優(yōu)化流動(dòng)相條件，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)可以明顯縮短，在較大的線性范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD和回收率等相關(guān)指標(biāo)都有較好表現(xiàn)，可用于檢測(cè)低聚糖濃度含量較高的產(chǎn)品。

1.3 親水作用色譜-質(zhì)譜法

親水作用色譜-質(zhì)譜法是繼離子色譜-脈沖安倍檢測(cè)法后又一快速可靠的檢測(cè)方法，親水作用色譜（HILIC）是采用極性固定相（如硅膠或衍生硅膠）、含高濃度極性有機(jī)溶劑（如乙腈）和低濃度水溶液流動(dòng)相的色譜模式，具有和反相色譜正交的選擇性，所使用的流動(dòng)相與傳統(tǒng)反相色譜相似，弱洗脫劑為有機(jī)相，強(qiáng)洗脫劑為水相，可達(dá)到與反相色譜相似的柱效和對(duì)稱峰形，化合物的洗脫順序則與正相色譜相似，即以親水性增加的順序流出，極性小的物質(zhì)先流出，極性大的物質(zhì)后流出。

周鵬等人[25]利用此法檢測(cè)了茶葉中的低聚糖，結(jié)果表明各類糖在各自的線性范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)大于0.996，定量限為0.05～1.0 mg·L-1，回收率為90.1%～103.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.1%～5.4%。粱軍等人[26]利用親水作用色譜-質(zhì)譜法測(cè)定麻黃根多糖單糖的組成，結(jié)果顯示該方法在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)8種未衍生單糖成分的完全基線分離，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD均＜2.1%，各成分的回收率為30%～99.3%。

2 其他檢測(cè)方法

2.1 紅外反射光譜法

針對(duì)低聚糖檢測(cè)的色譜類方法日益增多，除了上述主流方法外還有研究者利用紅外反射光譜法對(duì)低聚糖進(jìn)行檢測(cè)，王瀟瀟等人[27]建立了大豆制品中寡糖含量的近紅外反射光譜預(yù)測(cè)模型，并探討樣品特性對(duì)預(yù)測(cè)效果的影響，以實(shí)現(xiàn)對(duì)其寡糖含量的快速預(yù)測(cè)。

2.2 核磁共振法

吉鑫等人[28]利用核磁共振法（NMR）測(cè)定食品中水蘇糖的含量，以檸檬酸作為定量外標(biāo)，琥珀酸和煙酰胺分別作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，建立了食品中水蘇糖NMR定量分析檢測(cè)方法，水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.025～6.40 g·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，與現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法相比，NMR法前處理操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)過程中避免了有機(jī)試劑的引入，單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間為7 min，極大地縮短了待測(cè)樣品的前處理時(shí)間，檢測(cè)效率顯著提高。NMR法還可以測(cè)定啤酒[29]中少量的化合物，無需將混合物分離。姜潔等人[30]利用NMR寬度法測(cè)定了嬰幼兒乳粉中蔗糖和乳糖的含量，它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)品與外標(biāo)摩爾濃度比為0.05～5.00范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；平均加標(biāo)回收率為100.19%～103.21%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.79%～3.57%，與色譜法相比該方法具有操作簡(jiǎn)便、取樣量小、選擇性好、無需標(biāo)準(zhǔn)品作參比等優(yōu)點(diǎn)。

此外，測(cè)定大豆低聚糖的方法還有薄層色譜層析法[31]、氣相色譜法[32]、液質(zhì)聯(lián)用[33]，熒光光譜法[34]、蒽酮比色法[35]，但是這些方法相對(duì)于上述方法，準(zhǔn)確度上有些差距。復(fù)合檢測(cè)方法也在不斷涌現(xiàn)，如薄層析聯(lián)合GC-MS、美拉德反應(yīng)比色法、化學(xué)顯色比色法以及熒光分析法等，各類創(chuàng)新的低聚糖檢測(cè)方法會(huì)在檢測(cè)技術(shù)高速發(fā)展同時(shí)層出不窮。

3 結(jié)語

目前大豆低聚糖測(cè)定主要是對(duì)蔗糖（雙糖）、水蘇糖（三糖）和棉子糖（四糖）進(jìn)行分離檢測(cè)，無論是哪種儀器分析方法，一般從進(jìn)樣到出峰結(jié)束過程時(shí)間都不超過15 min，并且研究趨勢(shì)是朝快（檢測(cè)時(shí)間短）、精（標(biāo)準(zhǔn)偏差小）、準(zhǔn)（加標(biāo)回收率好）、靈（檢出限低）發(fā)展，數(shù)據(jù)分析更科學(xué)，檢測(cè)思路打破局限，基于大豆低聚糖的理化性質(zhì)，組合檢測(cè)手段，優(yōu)化檢測(cè)方法，降低檢測(cè)成本，真正意義上提升檢測(cè)效率。