超聲輔助提取放線菌所產(chǎn)綠色素的工藝研究

◎ 劉 最，李玉中，何麗芳

（衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽 421008）

色素也稱之為著色劑，在醫(yī)藥、食品、化妝品和印染等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。隨著人們對綠色生活理念的提倡，天然色素以安全性能高，生物降解性和環(huán)境相容性好而備受青睞。其中微生物色素具有動植物色素不可比擬的特點，如易培養(yǎng)、發(fā)酵時間短、不受空間、季節(jié)和環(huán)境的限制等，因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然色素具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。放線菌是一類極為重要的微生物資源，由于可以產(chǎn)生許多化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和工業(yè)等領(lǐng)域。微生物在生長后期常產(chǎn)生各種水溶性或脂溶性的色素，如類胡蘿卜素、葉綠素、黑色素、靈菌紅素、紅曲色素和紫色桿菌素等，其中以鏈霉菌屬菌株所產(chǎn)色素居多[3]。靈菌紅素具有抗腫瘤、抗菌和免疫抑制等多種生物活性[4]。紅曲色素具有抗菌抗炎、抗癌和抗糖尿病等功能[5]。

綠色素的主要成分是葉綠素，主要用于捕獲光能，在抗菌、抗氧化、光合作用和解毒等方面具有重要的生理功能。葉綠素是一類鎂卟啉化合物，其中包含有葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素和細(xì)菌葉綠素等。主要存在于植物和藻類中，在微生物中也有被發(fā)現(xiàn)，如綠絲菌和綠硫細(xì)菌，能夠合成細(xì)菌葉綠素（BChl）c、細(xì)菌葉綠素d和細(xì)菌葉綠素e[6]。

目前關(guān)于綠色素的研究主要集中在植物上，如衛(wèi)強(qiáng)等[7]分析證實石楠葉綠色素為葉綠素類，具有較強(qiáng)的抗氧化活性；郗艷麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)香水檸檬果皮綠色素在取時間為75 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，液料比31∶1（mL·g-1），提取功率640 W條件下，提取效果最佳。而目前關(guān)于放線菌產(chǎn)綠色素的研究鮮有報道。菌株P(guān)TY-3為前期試驗分離得到的一株產(chǎn)綠色素的放線菌，已對其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，但是未對綠色素的提取工藝優(yōu)化和其穩(wěn)定性進(jìn)行研究。本文以產(chǎn)綠色素的放線菌PTY-3為試驗材料，采用單因素試驗和正交試驗法對綠色素的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為菌株P(guān)TY-3中綠色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)色素菌株P(guān)TY-3由本實驗室從土壤中篩選分離純化并保藏，經(jīng)初步形態(tài)鑒定為鏈霉菌屬

（Streptomycessp.）。

1.2 試劑與儀器

試劑：氫氧化鈉、無水乙醇、過氧化氫、葡萄糖、氯化鈉和亞硫酸鈉等，均為分析純。

儀器：DHG-9040A新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（寧波江南儀器廠）、博訊智能精密搖床（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、SB-5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計、HH-S恒溫水浴鍋（江蘇國勝實驗儀器廠）、SHIMADZU AUY220精密電子天平。

1.3 培養(yǎng)基

均采用高氏一號培養(yǎng)基。

1.4 色素的提取

采用有機(jī)溶劑浸提和超聲波破壁法，用無水乙醇作提取劑[9-10]。將發(fā)酵培養(yǎng)7 d的液體培養(yǎng)基4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，洗滌，并進(jìn)行凍干。稱取菌體干粉0.1 g，加入無水乙醇10 mL，搖勻后置于超聲波清洗儀中進(jìn)行冰浴提取，離心收集上清液即為乙醇色素提取液。重復(fù)提取至菌體變白且無明顯顏色變化，合并提取液，待用。

1.5 色素最大吸收波長的測定

取適量色素浸提液進(jìn)行稀釋，在波長為400～700 nm范圍內(nèi)用紫外可見分光光度計進(jìn)行掃描，繪制色素的光譜吸收曲線圖。

1.6 色素提取的單因素試驗

采用1.4提取方法，分別在不同乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%和80%）、不 同 超 聲時 間（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min）、不同超聲溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）、不同料液比（1∶15、1∶30、1∶45、1∶60、1∶75和1∶90）條件下進(jìn)行浸提，測定吸光度。

1.7 色素提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度和料液比這4個因素為自變量，色素的吸光度值為因變量，采用L9（34）正交試驗法對色素的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色素的光譜特征

用無水乙醇作為提取劑，采用超聲波輔助法提取的色素溶液，在400～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知該色素在435 nm處有最大吸收峰。大多數(shù)葉綠素的吸收光譜區(qū)域有兩處：一個是在波長為640～660 nm的紅光部分，另一個在波長為430～450 nm的藍(lán)紫光部分。張愛梅等[11]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)綠色素放線菌菌SV-5的最大吸收峰在420 nm處；郭鳳華等[12]發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)綠色素的土壤細(xì)菌的最大吸收峰為402 nm。因此，可將435 nm作為色素的最大吸收波長。

圖1 綠色素的光譜曲線圖

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對綠色素提取效果的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度在30%～50%范圍內(nèi)時，綠色素的吸光度值隨著提取劑乙醇濃度的增加而升高。當(dāng)提取劑濃度達(dá)到50%時，色素的吸光度達(dá)到最大值，提取效果最好，之后逐漸下降。可能是與綠色素的主要成分葉綠素的親水基團(tuán)有關(guān)。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時，葉綠素中的親水基團(tuán)基本上能與水結(jié)合并溶解在水中。乙醇濃度增大時，水分含量越來越低，親水基團(tuán)不易與蛋白質(zhì)分離，不利于綠色素從類囊體薄膜中游離出來，親水基團(tuán)與水結(jié)合的能力也會降低，提取率則會降低[13]，隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，其他脂溶性雜質(zhì)也會增多，影響色素的溶出，也不利于色素的提取。因此選擇50%為提取劑乙醇的最佳濃度值。

圖2 乙醇濃度對綠色素吸光度的影響圖

2.2.2 超聲時間對綠色素提取效果的影響

由圖3可知，當(dāng)超聲時間增加時，色素的吸光度值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。超聲時間為60 min時，綠色素的吸光度達(dá)到最大值。劉永等人[14]的研究結(jié)果表明超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)能夠迅速破壞細(xì)胞組織，使得綠色素被充分溶解并析出，溶劑中綠色素含量迅速上升。但超聲作用時間繼續(xù)延長會使綠色素化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，并且隨著在空氣中暴露時間的延長，會導(dǎo)致綠色素易發(fā)生降解氧化，不利于色素的提取，造成綠色素的含量下降，溶液中的吸光度值反而下降。同時，超聲時間過長也會導(dǎo)致提取劑乙醇揮發(fā)，溶劑與綠色素的接觸面積減小，綠色素不能完全浸出，提取率也會降低。因此選取60 min為最佳提取時間。

圖3 超聲時間對綠色素吸光度的影響圖

2.2.3 超聲溫度對綠色素提取效果的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲溫度在30～50 ℃范圍內(nèi)時，隨著超聲溫度的升高，色素的吸光度值逐漸增大。當(dāng)超聲提取溫度達(dá)到50 ℃時，色素的吸光度達(dá)到峰值，此后隨溫度的增加吸光度反而下降。主要是因為溫度過低時色素不能充分被析出。隨著溫度的升高，分子熱運(yùn)動加快，可以促進(jìn)色素溶進(jìn)溶劑，綠色素的提取率逐漸增大；但溫度過高會讓色素的穩(wěn)定性受到了比較大的影響，綠色素結(jié)構(gòu)遭到破壞或被分解，吸光度降低[15]。因此將色素提取的最佳超聲溫度設(shè)置為50 ℃。

圖4 超聲溫度對綠色素吸光度的影響圖

2.2.4 料液比對綠色素提取效果的影響

由圖5可知，色素的吸光度值隨料液比的增加呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，當(dāng)料液比為1∶45（g·mL-1）時，色素的吸光度值達(dá)到最大。之后隨料液比的增加，吸光度值逐漸下降。原因可能是在一定范圍內(nèi)，由于料液比體積的增加，乙醇滲透細(xì)胞膜的效果越好，超聲波對細(xì)胞的作用越強(qiáng)，利于綠色素從細(xì)胞中分離出來進(jìn)入到乙醇中，可以增大提取劑與色素的接觸面積，色素類物質(zhì)向溶劑溶出的阻力減小，便于色素的溶出，增加提取液中色素的含量，提取效果達(dá)到最佳。當(dāng)料液比達(dá)到一定量時，色素的有效成分基本達(dá)到飽和，同時溶解出的雜質(zhì)也會增加，導(dǎo)致傳質(zhì)阻力增大，提取量有所下降。因此選取最佳料液比為1∶45（g·mL-1）。

圖5 料液比對綠色素吸光度的影響圖

2.3 正交試驗結(jié)果

選取乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度和料液比這4個因素為自變量，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗，結(jié)果見表2。

由表2可知，從極差（R）的大小來看，對色素提取效果影響最大的是超聲溫度，其次是料液比和超聲時間，影響最小的乙醇濃度。根據(jù)K值確定色素提取的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D1，即乙醇濃度為50%，超聲時間為60 min，超聲溫度為50 ℃，料液比為1∶30（g·mL-1）。為進(jìn)一步確定色素提取的最佳工藝條件，對正交試驗的提取條件組合A2B2C2D1進(jìn)行試驗驗證，結(jié)果表明，色素吸光度平均值為0.631。說明不同因素之間會存在一定的相互促進(jìn)作用，優(yōu)化后色素的吸光度值有得到一定程度的提高。因此，綠色素提取的最優(yōu)工藝條件組合為A2B2C2D1。

表2 正交試驗結(jié)果表

3 結(jié)論

（1）該色素在400～700 nm的最大吸收波長為435 nm。

（2）利用正交試驗確定綠色素的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，時間60 min，溫度50 ℃，料液比1∶30（g·mL-1），在此條件下，色素的吸光度平均值為0.631，相比優(yōu)化前明顯已得到提高。