T細(xì)胞中Tim-3異常表達(dá)對胃癌進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制

郭艷 魏小娟 高琦

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

胃癌是發(fā)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率居全球惡性腫瘤第4位，死亡率居全球惡性腫瘤第2位〔1〕。目前臨床對胃癌患者多采用根治性手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療方案，能夠改善患者臨床癥狀，縮小原發(fā)病灶，降低腫瘤分期，減緩腫瘤進(jìn)展速度，但胃癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者遠(yuǎn)期生存時(shí)間仍較短〔2〕。因此研究胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素，尋找新的有效治療方案，對提升患者預(yù)后有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)〔3〕免疫系統(tǒng)在腫瘤控制中具有重要作用，免疫系統(tǒng)失衡會(huì)促進(jìn)腫瘤病情進(jìn)展。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白(Tim)-3是在某些T細(xì)胞亞類表達(dá)的免疫調(diào)控分子，能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫耐受〔4〕。有研究顯示〔5〕Tim-3在胃癌組織T細(xì)胞中異常表達(dá)并與胃癌發(fā)生相關(guān)，但T細(xì)胞中Tim-3異常表達(dá)對胃癌進(jìn)展的影響機(jī)制尚未明確。本研究就T細(xì)胞中Tim-3異常表達(dá)對胃癌進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性選擇2018年5月至2019年5月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院收治的107例胃癌患者，收集其手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁正常組織。107例胃癌患者中，男71例，女36例；年齡60～80〔平均(67.68±5.13)〕歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃癌經(jīng)病理活檢確診〔1〕；②入院前未接受任何抗胃癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病歷資料不完整；②合并重要臟器功能不全、糖尿病、高血壓、過敏性疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、心腦血管疾病、精神系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、其他惡性腫瘤；③依從性不好，不能配合完成本研究。

1.2研究方法

1.2.1采用流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌組織及癌旁正常組織CD4+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)水平 收集其手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁正常組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)，上海廣銳生物科技有限公司)清洗，剪碎，用RPMI-1640培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)調(diào)整體積為50 ml，加入終濃度為0.002%Ⅰ型DNA酶(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)、0.1%Ⅳ型膠原酶(上海群己生物科技有限公司)、0.01%透明質(zhì)酸酶(上海樊克生物科技有限公司)，連續(xù)磁力攪拌3～4 h，用100目鋼網(wǎng)過濾，收集100 μl單細(xì)胞懸液，采用離心機(jī)(上海知正離心機(jī)有限公司，型號：GQ145)，3 000 r/min離心20 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，加至Ficoll離心管(北京索萊寶科技有限公司)內(nèi)，2 500 r/min離心10 min，吸取中間單個(gè)核細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，向各管中加入Tim-3-PE/CD4-FITCmAb(北京孚博生物科技有限公司)及相應(yīng)的同型對照抗體(北京博蕾德生物科技有限公司)進(jìn)行標(biāo)記，4℃避光30 min，2 500 r/min離心15 min，棄上清，采用流式細(xì)胞儀(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司，型號：EXFLOW-206)檢測胃癌組織及癌旁正常組織CD4+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)水平。

1.2.2分組及處理 將胃癌AGS細(xì)胞(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)分為空白對照組、陰性對照組、Tim-3過表達(dá)組，進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，細(xì)胞消化、傳代，取對數(shù)生長期的胃癌AGS細(xì)胞，以5×106個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清(上海覓拓生物科技有限公司)的DMEM培養(yǎng)基(上海博湖生物科技有限公司)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱(廣州南方生化醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號：SCO2W-2)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，空白對照組不作任何處理，陰性對照組轉(zhuǎn)染10 μg pEGFP-N1質(zhì)粒(上?？吕咨锟萍加邢薰?，Tim-3過表達(dá)組轉(zhuǎn)染10 μg pEGFP-N1-Tim-3質(zhì)粒(武漢維克賽思科技有限公司)，轉(zhuǎn)染結(jié)束繼續(xù)培養(yǎng)48 h。所有轉(zhuǎn)染操作按照北京嘉美臻元生物技術(shù)有限公司的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。

1.2.3采用CCK8法檢測各組胃癌AGS細(xì)胞增殖能力 取轉(zhuǎn)染后的各組胃癌AGS細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種密度為2×103個(gè)/孔，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁生長后每孔加入10 μl CCK-8溶液(南京恩晶生物科技有限公司)，37℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀(大連華洋分析儀器有限公司，型號：CD MICROPLATE READER)測定480 nm波長處各孔光吸收值(OD)，計(jì)算胃癌AGS細(xì)胞增殖率=(處理組OD/對照組OD)×100%。

1.2.4采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組胃癌AGS細(xì)胞侵襲能力 取轉(zhuǎn)染后的各組胃癌AGS細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，在Transwell小室的上室鋪入基質(zhì)膠(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，60 μl/孔)，然后加入細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞)，200 μl/孔，在Transwell小室的下室加入600 μl DMEM培養(yǎng)液，37℃孵育24 h，24 h后棄上室液體，4%多聚甲醛溶液(上海源葉生物科技有限公司)固定細(xì)胞，風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫(臨沂艾澤拉斯生物科技有限公司)染色，PBS漂洗，于熒光顯微鏡(上海千欣儀器有限公司，型號：Ts2R)下觀察并計(jì)算穿過小室膜的平均細(xì)胞數(shù)，以此表示胃癌AGS細(xì)胞侵襲能力。

1.2.5采用Western印跡檢測各組胃癌AGS細(xì)胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染后的各組胃癌AGS細(xì)胞，勻漿，裂解，離心，提取蛋白，使用BCA試劑盒(南京卡米洛生物工程有限公司)對蛋白進(jìn)行定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入1∶200稀釋的兔抗Tim-3單克隆抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)、1∶400稀釋的兔抗Wnt3單克隆抗體(上?？道噬锟萍加邢薰?、1∶500稀釋的兔抗GAPDH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司)，4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(廈門研科生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育60 min，洗膜，ECL發(fā)光試劑盒(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司)顯色，洗片后顯影、定影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，分析各組胃癌AGS細(xì)胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織及癌旁正常組織CD4+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)水平 胃癌組織CD4+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)水平〔(16.25±7.36)%〕顯著高于癌旁正常組織〔(5.71±1.88)%；t=14.353,P<0.001〕。

2.2各組胃癌AGS細(xì)胞增殖能力、侵襲能力 Tim-3過表達(dá)組胃癌AGS細(xì)胞增殖能力、侵襲能力明顯高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)；陰性對照組胃癌AGS細(xì)胞增殖能力、侵襲能力較空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組胃癌AGS細(xì)胞增殖能力、侵襲能力

圖1 各組胃癌AGS細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫，×100)

2.3各組胃癌AGS細(xì)胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達(dá)水平 Tim-3過表達(dá)組胃癌AGS細(xì)胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達(dá)水平明顯高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)；陰性對照組胃癌AGS細(xì)胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達(dá)水平較空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖2、表2。

圖2 各組胃癌AGS細(xì)胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達(dá)水平

表2 各組胃癌AGS細(xì)胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達(dá)水平

3 討 論

胃癌為一種常見消化道惡性腫瘤，主要由幽門螺桿菌(Hp)感染、不良飲食習(xí)慣、不良生活方式、環(huán)境污染等因素所致，早期胃癌癥狀不具備特異性，通常表現(xiàn)為惡心、嘔吐、上腹不適等類似胃炎或胃潰瘍的上消化道癥狀，不能引起患者重視，隨著腫瘤生長，如腫瘤破壞血管，可有嘔血、黑便等消化道出血癥狀，如腫瘤侵犯胰腺被膜，可出現(xiàn)腰背部持續(xù)疼痛，如癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可觸及腫大淋巴結(jié)〔6〕。根治性手術(shù)、放射性治療、化學(xué)藥物治療等相互配合的綜合治療方案對胃癌患者具有一定療效，但胃癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者多預(yù)后不良。

胃癌發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因、多步驟、多階段的過程，腫瘤免疫逃逸是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要因素之一，而腫瘤免疫逃逸與T細(xì)胞關(guān)系密切〔7〕。T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組分，能夠直接殺傷靶細(xì)胞，促進(jìn)特異性抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)、輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抑制腫瘤形成〔8〕。Tim-3是在某些T細(xì)胞亞類表達(dá)的免疫調(diào)控分子，能夠調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞(Th)1免疫應(yīng)答，介導(dǎo)細(xì)胞免疫耐受〔9〕。Tim-3基因位于5號染色體5q33.2，由301個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)上包含胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、免疫球蛋白樣區(qū)、黏蛋白樣區(qū)〔10〕。有研究顯示在T細(xì)胞上高表達(dá)的Tim-3會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能紊亂〔11〕。另有研究顯示Tim-3與其配體半乳糖凝集素(Galectin)-9的相互作用能夠參與免疫系統(tǒng)負(fù)性調(diào)節(jié)，在抗腫瘤免疫及過敏性皮炎(AD)、過敏性鼻炎(AR)等過敏性疾病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性腦脊髓硬化癥(MS)等自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用〔12〕。既往研究報(bào)道阻斷Tim-3信號通路后能夠部分恢復(fù)T細(xì)胞的抗腫瘤活性〔13〕。臨床數(shù)據(jù)顯示Tim-3在胃癌組織CD4+T細(xì)胞上和CD8+T細(xì)胞上均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度相關(guān)〔14〕。本研究顯示胃癌組織CD4+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，這與上述研究〔14〕結(jié)果一致，提示Tim-3在胃癌患者CD4+T細(xì)胞中呈高表達(dá)，Tim-3可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。

本研究選用胃癌AGS細(xì)胞作為研究材料，分析Tim-3高表達(dá)對胃癌進(jìn)展的影響，發(fā)現(xiàn)Tim-3高表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌進(jìn)展。隨著臨床基礎(chǔ)研究的不斷深入，與膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系的Wnt/β-catenin信號通路逐漸受到廣大學(xué)者的關(guān)注。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長、分化的關(guān)鍵途徑，在腫瘤干細(xì)胞(CSCs)分化及成瘤中發(fā)揮重要作用〔15〕。Wnt3為Wnt/β-catenin信號通路中的一種重要蛋白，可與細(xì)胞膜受體蛋白卷曲蛋白(FZD)、散亂蛋白(Dsh)相互作用，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異常聚集，從而調(diào)節(jié)其下游基因轉(zhuǎn)錄〔16〕。本研究提示Tim-3高表達(dá)可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲，從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展，這可為胃癌免疫治療提供新的方向。

綜上所述，Tim-3在胃癌患者CD4+T細(xì)胞中呈高表達(dá)，Tim-3高表達(dá)可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲，從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展。但Tim-3對胃癌進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制是否還有其他，有待進(jìn)一步研究。