槲皮素調(diào)控p53表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞惡性行為的作用

邵延萱 羅文哲 張輝

(佳木斯大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2018年的一項(xiàng)研究表明，全球胃癌的新發(fā)病例約為100萬(wàn)例，死亡人數(shù)亦達(dá)到7.83萬(wàn)例，分別位列所有惡性腫瘤的第五位和第三位〔1～3〕。

槲皮素又稱槲皮黃素，是一種廣泛存在于多種蔬菜和水果中的天然醇羥基黃酮類化合物，其在紅洋蔥、石榴、藕、紅提和芒果等食物中含量居多〔4〕。作為一種重要的多酚化合物，槲皮素具有廣泛的生物學(xué)和藥物學(xué)功效，主要包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗衰老、降糖和保護(hù)心血管等作用〔5〕。已有大量研究證實(shí)，槲皮素可經(jīng)不同的信號(hào)通路顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔6～9〕。如一項(xiàng)有關(guān)肺癌的研究報(bào)道，不同濃度的槲皮素均可顯著抑制A549、H1299和H460腫瘤細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生凋亡，且該作用與其上調(diào)腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員6(FAS)、TNFR1等細(xì)胞死亡和凋亡相關(guān)通路基因和下調(diào)核因子(NF)-κB、蛋白激酶B(AKT)等細(xì)胞存活相關(guān)通路基因的表達(dá)有關(guān)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度槲皮素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，探討和明確槲皮素治療胃癌的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、試劑、材料及儀器 SCG7901人胃癌細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)；槲皮素購(gòu)自金穗生物公司；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管和Transwell細(xì)胞小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、30%丙烯酰胺單體貯液、青鏈霉素雙抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Milipore公司；鼠抗p53單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abways公司；鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(actin)單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；cDNA第一鏈合成試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像采集及分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司；電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱和全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)蔡司公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)貝克曼公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將SCG7901人胃癌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后接種于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)和分組，并將各組細(xì)胞分別重懸于含槲皮素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，對(duì)照組和槲皮素組培養(yǎng)基中的槲皮素終濃度分別為0、20、40和60 μmol/L。

1.3細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCG7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板的各孔中，每孔接種的細(xì)胞數(shù)為2×103個(gè)；將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和槲皮素組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞分別用含終濃度為0、20、40和60 μmol/L 槲皮素的100 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)；在細(xì)胞于37℃含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h的各時(shí)間點(diǎn)上，分別棄除培養(yǎng)基，并向各孔中加入110 μl含10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基；隨后將細(xì)胞培養(yǎng)孔板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h；最后利用酶標(biāo)儀讀取各孔板培養(yǎng)基在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，該值反映細(xì)胞活性和增殖情況。

1.4細(xì)胞遷移 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCG7901人胃癌細(xì)胞分為對(duì)照組和槲皮素組，將2×104個(gè)細(xì)胞重置于100 μl培養(yǎng)基中接種于每個(gè)transwell上室中，各組所用的培養(yǎng)基分別為含終濃度為0、20、40、60 μmol/L槲皮素的無(wú)FBS RPMI1640培養(yǎng)基；各組transwell下室中為600 μl含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素RPMI1640完全培養(yǎng)基；將transwell單元在37℃含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；取出transwell單元，用醫(yī)用棉簽小心擦拭掉上室上表面未遷移的細(xì)胞；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，將上室置于70%的乙醇固定液中于室溫環(huán)境下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定30 min；用0.5%結(jié)晶紫染液于室溫環(huán)境下對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行染色；自來(lái)水沖洗、晾干后，將tranwell遷移膜在顯微鏡下觀察、拍照和計(jì)數(shù)，每個(gè)膜隨機(jī)選擇5個(gè)視野的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 將細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)提取總RAN和定量后，合成cDNA第一鏈，利用熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR并同時(shí)描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用融解曲線對(duì)各樣本的目的基因產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物和引物二聚體進(jìn)行區(qū)分。分別計(jì)算目的基因p53和內(nèi)參基因β-actin的Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)p53的mRNA表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，公式為：ΔCt=Ct(p53)-Ct(β-actin)。

1.6Western印跡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCG7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板的各孔中，每孔接種的細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)；將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和槲皮素組，各組培養(yǎng)基分別為1 ml含終濃度為0、20、40和60 μmol/L槲皮素的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)；細(xì)胞在37℃含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄除培養(yǎng)基后，用PBS清洗3次；向每孔中加入200 μl含1% PMSF的RIPA蛋白裂解液；劇烈吹打裂解細(xì)胞后，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移入離心管中；在4℃環(huán)境下將離心管于高速離心中機(jī)離心20 min(15 000 r /min)；吸取上清液并利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定裂解液中各樣本蛋白濃度；配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠；分別將30 μg各組樣本總蛋白加入不同凝膠泳道中進(jìn)行垂直電泳；利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，并用5%脫脂奶封閉液進(jìn)行室溫封閉1 h；PBS-吐溫(T)清洗3次后，將轉(zhuǎn)印膜分別置于p53(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)抗體稀釋液中，并在4℃冰箱中撫育過(guò)夜；次日，PBS-T清洗3次后，將轉(zhuǎn)印膜置于HRP標(biāo)記的二抗稀釋液中，并在37℃中孵育30 min；PBS-T清洗3次后，利用ECL和全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像采集及分析系統(tǒng)對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行顯影并測(cè)定光密度值，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1槲皮素抑制SCG7901人胃癌細(xì)胞的增殖能力 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組比較，40、60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞的增殖能力顯著降低；在48和72 h后，20、40、60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05;P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度槲皮素不同培養(yǎng)時(shí)間影響SCG7901細(xì)胞增殖能力

2.2槲皮素抑制SCG7901人胃癌細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，0、20、40、60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞的遷移數(shù)分別為(356.00±26.99)個(gè)、(310.00±25.06)個(gè)、(261.20±19.08)個(gè)和(212.80±10.92)個(gè)。與對(duì)照組比較，20、40、60 μmol/L槲皮素組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.01)。40 μmol/L槲皮素組遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于20 μmol/L槲皮素組(P<0.05)，60 μmol/L槲皮素組遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于40 μmol/L槲皮素組(P<0.01)。可見(jiàn)，槲皮素抑制SCG7901細(xì)胞遷移能力具有劑量依賴性。

2.3槲皮素上調(diào)SCG7901人胃癌細(xì)胞p53 mRNA和蛋白表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，槲皮素處理SCG7901細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，24 h后，60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高，48和72 h后各濃度槲皮素組的p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高(P<0.05；P<0.01)。見(jiàn)表2、3。

表2 培養(yǎng)不同時(shí)間不同濃度槲皮素影響SCG7901細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)

表3 不同濃度槲皮素影響SCG7901細(xì)胞p53 蛋白表達(dá)

3 討 論

研究已證實(shí)，槲皮素對(duì)人體多種腫瘤細(xì)胞均具有抑癌活性，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等〔11〕。與以往研究結(jié)果相似，本研究表明不同濃度的槲皮素可顯著抑制人SCG7901胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，且槲皮素可在mRNA和蛋白水平上調(diào)SCG7901細(xì)胞腫瘤抑制基因p53的表達(dá)。

p53是一個(gè)與人類多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的重要基因，它位于染色體17p13，包括突變型和野生型兩類〔12〕。功能研究證實(shí)，p53基因可通過(guò)形成一個(gè)四聚體轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而抑制和(或)活化下游目標(biāo)基因來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用，這些作用涉及細(xì)胞分化、凋亡、免疫應(yīng)答、癌癥發(fā)生、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和DNA功能等多個(gè)方面〔13〕。目前認(rèn)為，野生型p53是一種腫瘤抑制基因，而突變型p53則具有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力〔12〕。研究證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激損傷時(shí)(如DNA損傷)，野生型p53可精確控制細(xì)胞周期并誘導(dǎo)發(fā)生損傷的細(xì)胞以凋亡形式死亡〔14〕。野生型p53對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與其通過(guò)與促凋亡基因Bax啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合來(lái)轉(zhuǎn)錄激活Bax基因有關(guān)〔15〕。野生型p53對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控主要是通過(guò)誘導(dǎo)激活其下游產(chǎn)物p21，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期素依賴激酶(CDK)的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞周期阻滯于G1期〔16〕。此外，研究顯示野生型p53還可激活細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路，在抗腫瘤藥物奧沙利鉑治療大腸癌中發(fā)揮重要作用〔17〕。然而，當(dāng)p53基因發(fā)生突變或損傷后，可產(chǎn)生突變型p53，后者可促進(jìn)受損DNA發(fā)生凝聚，結(jié)果會(huì)使細(xì)胞發(fā)生異常轉(zhuǎn)化甚至發(fā)展為腫瘤〔14〕。實(shí)驗(yàn)表明，在不同的腫瘤組織中，p53基因均可發(fā)生不同程度的突變，且其在胃癌和胰腺癌等消化系統(tǒng)腫瘤中的突變率可達(dá)50%左右〔18〕。此外，研究證實(shí)p53基因在子宮頸癌患者中突變率也高達(dá)50%～65%，且突變型p53陽(yáng)性且強(qiáng)表達(dá)的癌組織侵襲能力更強(qiáng)〔14，19〕。

大量研究已證實(shí)p53基因在槲皮素發(fā)揮抗腫瘤活性中具有重要作用〔20～23〕。如在宮頸癌的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素可誘導(dǎo)HeLa和SiHa細(xì)胞G2期阻滯和細(xì)胞凋亡，增加p53下游兩個(gè)效應(yīng)物p21基因的轉(zhuǎn)錄和促凋亡Bax蛋白的水平，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)伴有p53及其核信號(hào)的增加〔23〕。綜上，槲皮素可顯著抑制SCG7901胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，該機(jī)制是通過(guò)其活化和上調(diào)p53腫瘤抑制基因，并進(jìn)而影響腫瘤惡性進(jìn)程得以實(shí)現(xiàn)的。