基于PI3K/Akt通路探究右美托咪定對(duì)麻醉所致大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

朱晶 張春霞 余喻

(1九江市第五人民醫(yī)院麻醉科，江西 九江 332000；2九江市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科)

舒芬太尼是臨床上常用的麻醉藥物之一，有起效快、蘇醒迅速的特點(diǎn)，在臨床廣泛應(yīng)用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持〔1,2〕。但臨床研究顯示，舒芬太尼的使用有神經(jīng)毒性，能夠促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，降低樹突棘的密度，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙〔3〕。右美托咪定是臨床常用的高選擇性受體激動(dòng)藥，能夠減輕臨床麻醉所帶來的對(duì)大腦損傷情況〔4,5〕。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路廣泛存在于各種神經(jīng)細(xì)胞中，是膜受體細(xì)胞信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑〔6,7〕。本研究旨在探究基于PI3K/Akt通路分析右美托咪定對(duì)麻醉所致大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取SD大鼠(哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：XYXK(黑)2020-001)30只，年齡3～6 w，平均(4.6±1.1)w，體重198～216 g，平均(207.3±6.9)g，所有大鼠在相對(duì)濕度40%～45%、光照12 h、溫度(23.8±1.5)℃環(huán)境中喂養(yǎng)1 w。隨后隨機(jī)分為對(duì)照組、舒芬太尼組、舒芬太尼+右美托咪定組各10只。本研究遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3-R原則，且通過醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)藥物、試劑、儀器：流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)；舒芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)；右美托咪定(天津西瑪科技有限公司)；Bax、Bcl-2、caspase3抗體(Santa Cruze Biotechnology 公司)。

1.2藥物干預(yù) 舒芬太尼組給予大鼠舒芬太尼10 μg/L進(jìn)行腹腔注射，舒芬太尼+右美托咪定組在舒芬太尼組的基礎(chǔ)上給予大鼠腹腔注射50 μg/kg，對(duì)照組給予大鼠等量生理鹽水腹腔注射。所有大鼠給藥14 d。

1.3神經(jīng)功能檢測 各組大鼠干預(yù)24 h后進(jìn)行Y-迷宮實(shí)驗(yàn)：在Y-迷宮之后控制儀釋放電擊，電壓設(shè)置為70 V，延遲2 s對(duì)大鼠進(jìn)行足部電擊，控制儀中的反射箱內(nèi)安置3個(gè)信號(hào)燈，按照燈光信號(hào)對(duì)大鼠進(jìn)行電擊，讓大鼠逃離到安全區(qū)域。記錄各組大鼠Longa評(píng)分法，評(píng)分共分為5級(jí)，分?jǐn)?shù)越高證明大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 所有大鼠干預(yù)后斷頭處死，提取大鼠海馬組織，將提取的組織放置在15%甲醇進(jìn)行固定后常規(guī)石蠟包埋，3 μm下連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。

1.5細(xì)胞凋亡檢測 使用流式細(xì)胞儀對(duì)大鼠細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測：將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，使用0.25胰酶消化5 min后至細(xì)胞瓶呈霧狀之后，磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打下來，4℃、2 000 r/min離心3 min，PBS洗滌、離心、重懸2次，之后使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行分析。

1.6Bcl-2、Bax、caspase3、PI3K、Akt表達(dá)量檢測 使用Western印跡法檢測Bcl-2、Bax、caspase3、PI3K、Akt表達(dá)量：對(duì)標(biāo)本以PBS沖洗后，行30 min裂解，后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測定。選擇20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加完成蛋白緩沖液后進(jìn)行10 min電泳，后將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%牛奶中，在常溫環(huán)境下進(jìn)行90 min封存。后結(jié)合一抗、稀釋，進(jìn)行1 d孵育，取出以TBST液沖洗，后結(jié)合二抗，保存60 min后開始清洗與顯色，對(duì)Bcl-2、Bax、caspase3、PI3K、Akt表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 舒芬太尼組Y迷宮實(shí)驗(yàn)中Longa評(píng)分、逃離時(shí)間、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)顯著高于對(duì)照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)，舒芬太尼+右美托咪定組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

2.2各組不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較 舒芬太尼組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)；舒芬太尼+右美托咪定組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力及不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較

2.3海馬區(qū)組織HE染色圖 對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，核仁完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)較為清晰。舒芬太尼組大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞核明顯腫脹，染色質(zhì)密度降低，線粒體空泡化等細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷。舒芬太尼+右美托咪定組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷減輕，表現(xiàn)為細(xì)胞核腫脹現(xiàn)象減少，染色質(zhì)密度逐漸整改，線粒體結(jié)構(gòu)趨于正常。見圖1。

圖1 海馬區(qū)組織HE染色(×400)

2.4各組Bcl-2、Bax、caspase3表達(dá)比較 舒芬太尼組Bcl-2表達(dá)顯著低于對(duì)照組、舒芬太尼+右美托咪定組，Bax、caspase3表達(dá)顯著高于對(duì)照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)；舒芬太尼+右美托咪定組Bcl-2表達(dá)顯著低于對(duì)照組，Bax、caspase3表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2，圖2。

2.5各組PI3K、Akt表達(dá)量對(duì)比 舒芬太尼組PI3K、Akt表達(dá)顯著高于對(duì)照組、舒芬太尼+右美托咪定組(P<0.05)，舒芬太尼+右美托咪定組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2，圖3。

表2 各組Bcl-2、Bax、caspase3相對(duì)表達(dá)量及PI3K、Akt表達(dá)量比較

1～3:對(duì)照組，舒芬太尼組，舒芬太尼+右美托咪定組；同圖3圖2 Western印跡檢測Bcl-2、Bax、caspase3相對(duì)表達(dá)量

圖3 Western印跡檢測PI3K、Akt表達(dá)量

3 討 論

麻醉是由藥物或其他方式造成中樞神經(jīng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的可逆性功能抑制，這種抑制的特點(diǎn)主要是感覺、痛覺的喪失〔8,9〕。麻醉作為臨床手術(shù)時(shí)常用的干預(yù)方式，在起到較好干預(yù)效果的同時(shí)會(huì)對(duì)患者長時(shí)期的行為改變，患者學(xué)習(xí)、記憶等功能出現(xiàn)異常，提示麻醉可能損傷中樞神經(jīng)〔10〕。

右美托咪定作為一種有效的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，其是美托咪定的右旋異構(gòu)體，通過激動(dòng)腦及脊髓的α2受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及抗交感作用。臨床研究顯示，右美托咪定對(duì)多種腦損傷模型進(jìn)行干預(yù)，對(duì)神經(jīng)保護(hù)有較好的作用〔11,12〕。本研究結(jié)果說明右美托咪定能夠使大鼠神經(jīng)功能及記憶功能得到有效改善。

大腦神經(jīng)海馬細(xì)胞的凋亡是引起大鼠神經(jīng)功能受損的重要因素之一，細(xì)胞凋亡的過程受到各種基因調(diào)控。caspase家族及Bcl-2家族關(guān)于海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究較多〔13,14〕。其中caspase3、caspase9是臨床最常見的caspase凋亡因子，caspase3主要是通過caspase9自身裂解后獲得活性，從而引起細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族中的Bcl-2蛋白、Bax蛋白在臨床也能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bcl-2屬于一種常見的抑癌蛋白，Bax屬于一種凋亡誘導(dǎo)基因，兩者結(jié)合以二聚體的形式存在，在細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮重要作用〔15,16〕。趙允起等〔17〕在臨床研究中指出，使用七氟烷吸入麻醉能夠降低大鼠海馬區(qū)Bcl-2蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，使用右美托咪定對(duì)麻醉后大鼠進(jìn)行干預(yù)能夠降低大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率，有一定的干預(yù)效果。

有研究顯示，臨床中有多種信號(hào)通路能夠作用于細(xì)胞的增殖、凋亡。其中PI3K/Akt信號(hào)通路是臨床最為常見的一種，當(dāng)PI3K/Akt通路異常活化能夠促進(jìn)細(xì)胞的生存及細(xì)胞分裂〔18,19〕。PI3K/Akt通路作為酶聯(lián)受體介導(dǎo)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了生長因子、細(xì)胞因子等信號(hào)傳導(dǎo)的同時(shí)，還在細(xì)胞增殖、分化及凋亡中有重要角色，表現(xiàn)出了多種生物學(xué)功能。PI3K是由p110及p85亞單位所組成的異源二聚體，當(dāng)PI3K磷酸化后導(dǎo)致Akt蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變且轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，活化的Akt能夠激活下游靶基因mTOR參與細(xì)胞的增殖、凋亡〔20〕。夏洪蓮等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，使用異丙酚對(duì)缺血再灌注大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠通過PI3K/Akt通路抑制大鼠細(xì)胞凋亡率。本研究結(jié)果說明使用右美托咪定能夠抑制PI3K/Akt通路，從而抑制麻醉導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，有較好的干預(yù)效果。

綜上，使用右美托咪定對(duì)麻醉后大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠抑制PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase3表達(dá)，起到對(duì)麻醉所致大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的抑制，具有較好的干預(yù)效果。