冠心病患者與健康人群外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞微小RNA表達

劉一炫 趙雅紅 謝富蘭 蒙榮森 靳文

(廣東省第二人民醫(yī)院心內(nèi)三科，廣東 廣州 510300)

微小RNAs(miRNA)是在真核生物中存在且保守進化的非編碼內(nèi)源性RNA單鏈小分子，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用。miRNA與冠心病心肌細(xì)胞缺氧缺血狀態(tài)、血管壁細(xì)胞受損、脂質(zhì)代謝變化等病理機制密切相關(guān)〔1〕。在急性心肌梗死中，miRNA-21可促進血管受損后新生內(nèi)膜增生，對冠心病評估預(yù)后、診斷具有重要的臨床價值。外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞在動脈粥樣硬化的防治中具有重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能由多種miRNA進行調(diào)控，促進血管內(nèi)皮化和新生。有研究〔2〕指出，冠心病患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)目較少，生成血管能力、遷移、黏附、增殖能力損傷。本研究探討健康人群和冠心病病人外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞miRNA的表達水平。

1 資料和方法

1.1一般資料 選擇2016年6月至2017年3月廣東省第二人民醫(yī)院收治的冠心病患者60例為冠心病組，男37例，女23例，年齡42～77歲，平均(53.8±3.6)歲；體重指數(shù)(BMI)18～25 kg/m2，平均(23.7±1.8)kg/m2；病情嚴(yán)重程度：急性心肌梗死32例，心絞痛28例；病程2～7年，平均(4.5±2.1)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合世界衛(wèi)生組織制定的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕；經(jīng)冠狀動脈造影、臨床特征確診。同期選擇體檢健康者60例為對照組，其中男36例，女24例，年齡42～77歲，平均(53.7±3.6)歲；BMI 18～25 kg/m2，平均(23.8±1.8)kg/m2。兩組年齡、性別、BMI等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究對象均自愿參加本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能和數(shù)目產(chǎn)生影響的病變、血液系統(tǒng)病變、腫瘤、心肌病、梅毒、肝炎、哺乳期和妊娠女性、精神異常無法配合者，臨床資料缺失者。

1.2儀器和試劑 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、多聚甲醛、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)，麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)的Boyden 小室，Corning公司生產(chǎn)的96孔、24孔培養(yǎng)板，Thermo公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀，Zeiss公司生產(chǎn)的激光掃描共聚焦熒光顯微鏡，Olympus生產(chǎn)的倒置相差顯微鏡，Binder公司生產(chǎn)的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，阿爾泰公司生產(chǎn)的超凈工作臺，Eppendorf公司生產(chǎn)的水平低速離心機，山東奧塞特醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的5 ml肝素?zé)o菌抗凝管，Molecular Probe公司生產(chǎn)的Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?，Lonza公司生產(chǎn)的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(EGM)-2培養(yǎng)基，Millipore 公司生產(chǎn)的人纖維連接蛋白，Sigma公司生產(chǎn)的FITC標(biāo)記的荊豆凝集素I、人淋巴細(xì)胞分離液。7500熒光定量RCR儀，無RNA酶純水，無水乙醇，外源性cel-miR-39，熒光探針，實時熒光定量(qRT)-PCR試劑盒，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒。miRNA-21序列為UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。

1.3方法

1.3.1鑒定、培養(yǎng)、分離內(nèi)皮祖細(xì)胞 采集10 ml肘靜脈血，密度梯度離心法收集外周血單個核細(xì)胞24孔細(xì)胞培養(yǎng)板包被人纖維連接蛋白，接種單個核細(xì)胞，EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d，非貼壁細(xì)胞予以PBS除去，培養(yǎng)液更換至1 w，予以Dil-acLDL及FITC-UEA-I標(biāo)記細(xì)胞后，采用激光共聚焦顯微鏡鑒定，正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞為Dil-acLDL及FITC-UEA-I標(biāo)記染色雙陽性細(xì)胞。隨機選擇15個內(nèi)皮祖細(xì)胞，在200倍視野下取平均值。

1.3.2遷移能力實驗 收集貼壁細(xì)胞并消化，Boyden小室的下室加入50 μg/L血管內(nèi)皮生長因子和200 μl培養(yǎng)液。相同數(shù)量的內(nèi)皮祖細(xì)胞注入上室，在5%二氧化碳溫箱內(nèi)、37℃培養(yǎng)24 h；將濾膜上的未移動細(xì)胞刮去，予以甲醇3～5 min固定，DAPI染色10 min，沖洗蒸餾水，晾干后200倍顯微鏡下觀察向底層遷移的細(xì)胞。

1.3.3增殖能力實驗 收集貼壁細(xì)胞并消化，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板包被人纖維連接蛋白，接種內(nèi)皮祖細(xì)胞，每個標(biāo)本設(shè)置空白對照3個復(fù)孔，二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板，在飽和濕度、5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)24 h，將20 μl MTT液體加入每孔內(nèi)，培養(yǎng)4 h，除去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，震蕩器10 min充分震蕩，在490 nm波長的酶標(biāo)儀下檢測吸光度。

1.3.4黏附能力實驗 收集貼壁細(xì)胞并消化，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板包被人纖維連接蛋白，接種相同數(shù)目的內(nèi)皮祖細(xì)胞，在5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)30 min，隨機選擇9個貼壁細(xì)胞，200倍熒光顯微鏡下計數(shù)。全部研究對象在空腹下采集2 ml外周靜脈血，在4℃乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中放置，3 000 r/min離心10 min，-80℃保存上清液。行qRT-PCR檢測外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞miRNA-21、miRNA-150的表達水平。根據(jù)試劑說明書提取樣品總RNA，反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，取3次的平均值。

1.4觀察指標(biāo) 比較冠心病組、對照組的血清肌酸激酶(CK)、血清CK同工酶(CK-MB)、血清肌鈣蛋白(cTn)I水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移、黏附能力比較 冠心病組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目、遷移能力、增殖能力、黏附能力與對照組相比顯著下降(均P<0.01)，見表1，圖1。

圖1 兩組激光共聚焦顯微鏡檢查Dil-acLDL及FITC-UEA-I染色雙陽性(×200)

表1 兩組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目、增殖、遷移、黏附能力比較個)

2.2兩組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞miRNA表達水平比較 冠心病組外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞miRNA-21、mi-RNA-150表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 兩組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞miRNA表達水平比較

2.3兩組血清CK、CK-MB、cTnI水平比較 冠心病組的血清CK、CK-MB、cTnI水平與對照組比較顯著降低(P<0.01)，見表3。

表3 兩組CK、CK-MB、cTnI水平比較

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡的直接因素之一為心肌缺血，大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21在心肌缺血再灌注損傷和心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用〔4，5〕。預(yù)處理或熱休克可誘導(dǎo)miRNA-21表達，促使心肌梗死面積顯著下降，說明miRNAs介導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護機制中起到主要作用的是內(nèi)皮誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、熱休克蛋白70〔6，7〕。有研究〔8〕檢測心肌梗死患者心肌組織標(biāo)本的miRNAs表達水平，發(fā)現(xiàn)心肌梗死部位的內(nèi)部區(qū)域miRNA-21表達水平下降，而邊緣區(qū)miRNA-21顯著升高。在健康人中，心臟miRNA-21呈現(xiàn)低水平表達，但在心臟缺氧缺血、心肌肥厚、心衰患者中miRNA水平顯著上升〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可對L-型鈣通道蛋白表達水平進行負(fù)性調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度顯著下降，對心肌細(xì)胞肥大產(chǎn)生抑制作用。冠心病的開始環(huán)節(jié)為破壞了內(nèi)皮系統(tǒng)，維持內(nèi)皮的完整性可避免惡性心血管事件的發(fā)生，激活炎性反應(yīng)下段通路〔10，11〕。

本研究結(jié)果與葉小林等〔12〕的結(jié)果大體一致，miRNA配對靶基因的進程主要為：(1)對靶基因翻譯編碼蛋白質(zhì)的抑制產(chǎn)生抑制或降解作用；(2)對靶基因的半衰期進行改變；(3)進入細(xì)胞核，在轉(zhuǎn)錄水平對靶基因的表達進行沉默調(diào)控。miRNA可調(diào)控代謝酶、腳手架蛋白、信號蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等靶基因，在調(diào)控代謝網(wǎng)、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號網(wǎng)、調(diào)控基因網(wǎng)等生物分子網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。同時修復(fù)血管內(nèi)皮，血管內(nèi)皮受損后可經(jīng)由內(nèi)皮祖細(xì)胞進行再生分化，促使受損血管快速形成血管再內(nèi)皮化，抑制冠心病的病理進程。修復(fù)受損內(nèi)皮的內(nèi)皮祖細(xì)胞過程是一個較為復(fù)雜的歸巢過程，在基質(zhì)細(xì)胞源性因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等各種生長因子的作用下，內(nèi)皮祖細(xì)胞由骨髓中向外周血中動員，并向內(nèi)皮的受損部位進行遷移、黏附，在局部發(fā)生分化、存活、增殖，經(jīng)由旁分泌、融合、整合等方式在修復(fù)血管內(nèi)皮中發(fā)揮重要作用〔13,14〕。

綜上，冠心病患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)目較少，生成血管能力、遷移、黏附、增殖能力損傷，表達多種miRNA水平差異顯著。