LncRNA BLACAT1通過(guò)抑制miR-519d促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

郭改艷 舒麗莎

(1河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000； 2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科)

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率僅次于乳腺癌〔1〕。盡管在臨床上采用先進(jìn)的放射和化學(xué)療法技術(shù)，由于宮頸癌患者局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前患者的預(yù)后仍然不理想〔2〕。近年來(lái)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一組長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA，缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)率、翻譯和翻譯后修飾〔3〕。LncRNAs參與許多細(xì)胞功能，包括增殖、分化、遷移、侵襲和凋亡〔4〕。LncRNAs在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的生物學(xué)作用已被廣泛研究，一些LncRNA可作為預(yù)測(cè)預(yù)后或有望成為惡性腫瘤診斷的生物標(biāo)志物〔5,6〕。LncRNA BLACAT1在多種癌癥中異常表達(dá)，包括膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌等〔7～9〕。有薈萃分析表明BLACAT1高表達(dá)可預(yù)測(cè)總生存期縮短、TNM晚期、腫瘤分極差及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔10〕。LncRNA BLACAT1在卵巢癌組織和細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，敲降BLACAT1通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔11〕。LncRNA BLACAT1在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展的生物學(xué)作用尚未闡釋清楚。

miR-519d在宮頸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-519d通過(guò)靶向HIF-2α抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通過(guò)靶向Smad7促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移〔13〕。敲降BLACAT1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-519d/Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔11〕。目前，關(guān)于BLACAT1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-519d影響宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的研究尚未報(bào)道。本研究旨在探討B(tài)LACAT1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)和生物學(xué)功能的分子作用機(jī)制，為臨床宮頸癌早期診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1組織樣本 收集2018年1月至2019年10月12例來(lái)自河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科的宮頸癌組織及配對(duì)的癌旁組織樣本，保存在液氮中。所有患者已確診為宮頸癌，且手術(shù)前未進(jìn)行放化療等新輔助治療，患者家屬簽署本研究知情同意書(shū)，并經(jīng)倫理委員會(huì)同意。

1.2細(xì)胞系、主要試劑與儀器 人正常宮頸上皮細(xì)胞(End1/E6E7)和人宮頸癌細(xì)胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)均購(gòu)于中科院上海細(xì)胞研究所。NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于上海吉瑪生物公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó) Hyclone公司。Trizol試劑、SYBR Green Qpcr Super Mix、Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。Transwell細(xì)胞板、基質(zhì)膠為美國(guó)BD公司。CCK-8試劑盒購(gòu)于武漢華美公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒和報(bào)告基因載體購(gòu)于Promega公司。抗體E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)購(gòu)于美國(guó)CST。酶標(biāo)儀、PCR儀、凝膠成像儀均于買(mǎi)美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人正常宮頸上皮細(xì)胞(End1/E6E7)和人宮頸癌細(xì)胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)添加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，傳代，接種6孔板，以備轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)Lipofectamine 2000慢病毒包裝質(zhì)粒 NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集宮頸癌組織及癌旁組織和細(xì)胞，用TRizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，SYBR Green Qpcr Super Mix 進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。采用2-△△Ct法計(jì)算差異表達(dá)量。引物序列為BLACAT1-正義鏈： 5′-GCTGGAGTTTGTCCTGTCT-3′，BLACAT1-反義鏈： 5′-CTCATCGCCACCTGTTAT-3′；U6 snRNA-正義鏈:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 snRNA-反義鏈:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；hsa-miR-519d-正義鏈：5′-AAGTGCCTCCCTTTAGAGTGGT-3′，hsa-miR-519d-反義鏈： 5′-GGTGCA-GGGTCCGAGGTAT-3′。

1.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于96孔板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。分組轉(zhuǎn)染后，在24、48、72 h加入10 μl CCK-8試劑，放回培養(yǎng)箱，2 h后拿出進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光度(OD)值。

1.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 將轉(zhuǎn)染過(guò)的HeLa細(xì)胞，接種在Transwell小室的上室，細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/ml，下室加10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，干燥，200倍倒置顯微鏡觀察。細(xì)胞侵襲能力在小室里加入基質(zhì)膠。其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)步驟相同。

1.7Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量。計(jì)算等量蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)膜。加入5%脫脂牛奶封膜1 h，加入一抗放4℃冰箱過(guò)夜，一抗?jié)舛菶-cadherin(1 000∶1)、N-cadherin(800∶1)、Vimentin(1 500∶1)、GAPHD(500∶1)。洗膜，加入二抗，洗膜，加入化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影蛋白。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度。

1.8熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證LncRNA BLACAT1與miR-519d靶向關(guān)系 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后，擴(kuò)增LncRNA BLACAT1與miR-519d結(jié)合片段并導(dǎo)入到熒光素酶載體中構(gòu)建野生型質(zhì)粒。將其結(jié)合片段進(jìn)行核苷酸突變，即為突變型質(zhì)粒。參照Lipofectamine 2000操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染NC，miR-519d mimic，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。根據(jù)雙熒光素酶試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)和海腎熒光活性值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA BLACAT1在宮頸癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織(1.02±0.09)相比，LncRNA BLACAT1在宮頸癌組織中的mRNA表達(dá)水平(6.13±0.27)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=62.20，P=0.000)。

2.2LncRNA BLACAT1在宮頸癌細(xì)胞系中高表達(dá) 與End1/E6E7細(xì)胞(1.00±0.06)相比，LncRNA BLACAT1在宮頸癌細(xì)胞系(C33a、SiHa、Caski和 HeLa)中mRNA表達(dá)水平(2.19±0.20、3.53±0.17、4.27±0.21、5.09±0.19)顯著升高(t=8.34、17.73、22.92、28.66，均P=0.000)，且HeLa細(xì)胞中LncRNA BLACAT1的mRNA表達(dá)水平最高。

2.3敲降LncRNA BLACAT1抑制宮頸癌細(xì)胞增殖 與NC shRNA組(1.03±0.05)相比，BLACAT1 shRNA組中LncRNA BLACAT1 mRNA表達(dá)水平(0.41±0.02)顯著降低(t=19.94，P=0.000)。與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組在24、48、72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 敲降LncRNA BLACAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞活力的影響

2.4敲降LncRNA BLACAT1抑制宮頸癌細(xì)胞遷移與轉(zhuǎn)移 與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組中HeLa細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.000)。見(jiàn)圖1，表2。

表2 敲降LncRNA BLACAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響個(gè))

圖1 敲降LncRNA BLACAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

2.5各組N-cadherin、Vimentin及E-cdaherin蛋白表達(dá)比較 與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著減少，E-cadherin蛋白水平顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 敲降LncRNA BLACAT1后對(duì)宮頸癌細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)量的影響

2.6LncRNA BLACAT1靶向調(diào)節(jié)miR-519d 通過(guò)Stabase 2在線分析軟件預(yù)測(cè)miR-519d可能是LncRNA BLACAT1的靶基因。野生型組(WT)中，過(guò)表達(dá)miR-519d 熒光素酶活性(0.45±0.02)顯著低于NC組(0.98±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.46，P=0.001)。與NC shRNA組(0.49±0.11)相比，BLACAT1 shRNA組中miR-519d表達(dá)水平(0.98±0.12)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.214,P=0.003)。

3 討 論

迄今為止，在宮頸癌的預(yù)防、診斷和治療方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展〔14〕。但由于宮頸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，傳統(tǒng)手術(shù)、放射治療和化療對(duì)患者的治療仍然有限〔15〕。如果宮頸癌患者可得到早期診斷和早期治療，5年生存率可高達(dá)90%〔16〕。然而，宮頸癌的早期癥狀并不明顯。70%的宮頸癌患者都是女性，中晚期約占總發(fā)病率的31%，宮頸癌經(jīng)治療后會(huì)復(fù)發(fā)，且預(yù)后極差〔17,18〕。因此，尋找有效的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物是宮頸癌診斷和治療的迫切需要

LncRNAs是一種新的基因表達(dá)調(diào)控因子，在各種疾病病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。近年來(lái)，LncRNAs已成為多種人類(lèi)惡性腫瘤的研究熱點(diǎn)〔19〕。先前研究表明LncRNA BLACAT1在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，如乳腺癌〔20〕、頭頸鱗癌〔21〕和骨肉瘤癌〔22〕。然而，BLACAT1在宮頸癌中的作用尚不清楚。目前發(fā)現(xiàn)BLACAT1在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)異常增加。LncRNAs在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用已被廣泛報(bào)道〔23,24〕。據(jù)報(bào)道在小鼠體內(nèi)，BLACAT1基因敲除降低了胃癌腫瘤的生長(zhǎng)〔25〕。研究報(bào)道BLACAT1基因敲除可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔26〕。本文結(jié)果表明，敲降BLACAT抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，表明BLACAT1在癌癥進(jìn)展中起抑癌基因的作用。

LncRNAs可能作為miRNAs發(fā)揮作用“海綿”來(lái)減弱不同miRNAs的水平。例如：LncRNA LIPE-As1在宮頸癌組織中過(guò)表達(dá)，可以預(yù)測(cè)宮頸癌的生存率低，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-195-5p/MAPK促進(jìn)癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移〔27〕。有研究報(bào)道過(guò)表達(dá)miR-519d通過(guò)靶向HIF-2α抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通過(guò)靶向Smad7促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移〔13〕。因此，敲降BLACAT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-519d抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，BLACAT1在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向負(fù)調(diào)節(jié)miR-519d參與宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲功能。本研究為BLACAT1在宮頸癌中生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)，為宮頸癌早期診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。