楊曉煒 劉鳳海 刁慧杰 石文秀 姚立巖
(牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)
缺血性腦卒中常伴不同程度的感覺、運動和認知功能等障礙,其致殘和致死性很高〔1,2〕。缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要病理過程。炎癥反應(yīng)是造成缺血再灌注損傷的重要機制〔3〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α是近年新發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的炎癥因子,參與缺血性腦卒中的炎癥免疫過程。TNF-α 是炎癥反應(yīng)的始動因子,在腦缺血再灌注早期,TNF-α合成和釋放增加是促進缺血性腦卒中形成的重要原因〔4〕。因此,抗TNF-α等抗炎治療成為缺血性腦卒中治療的研究熱點。然而,抗炎治療在臨床實踐中卻常常達不到預(yù)期效果。如能探明 TNF-α 在腦缺血中損傷保護的平衡點及關(guān)鍵點,讓其在最適宜的時間發(fā)揮其最有利的作用對臨床缺血性腦卒中的治療將極為重要〔5〕。
抗TNF-α干預(yù)方法很多,益賽普〔注射用重組人Ⅱ型TNF受體-抗體融合蛋白(rhTNFR:Fc)〕是目前國內(nèi)使用最廣泛的一種 TNF-α 拮抗劑,益賽普是細胞表面 TNF-α 受體的競爭性抑制劑,可以抑制 TNF-α 生物活性,從而阻斷 TNF-α介導(dǎo)的細胞反應(yīng)〔6〕。益賽普在臨床上已長期應(yīng)用,其抗炎效果及安全性比較可靠。本研究在建立了大鼠局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO/R)〔7〕基礎(chǔ)上,以益賽普作為抗TNF-α的干預(yù)用藥,于大鼠腦缺血再灌注不同時程嘗試用益賽普干預(yù)缺血再灌注后的腦損傷,并將各時點干預(yù)效果與常規(guī)用藥阿托伐他汀對比,論證最有效的干預(yù)時機及干預(yù)效果。
1.1實驗動物 清潔級健康老年雄性SD大鼠,224只,體重300~350 g。 溫度(25±1)℃,濕度50%±10%,自由覓食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。
1.2主要儀器和試劑
1.2.1主要儀器 -80℃冰箱(Haier 青島)、-20℃冰箱(Haier 青島)、4℃低速離心機(AXTDL5M-II 上海)、酶標儀(Bio-Rad Laboratories 上海)、微量加樣器(Research plus 德國)、分析天平(FA1204B 上海)、干燥箱(DZF 上海)。
1.2.2主要試劑 注射用重組人Ⅱ型TNF受體-抗體融合蛋白 (上海中信國健藥業(yè)有限公司)、阿托伐他?。杭兌却笥?9.19%(廣東陽江制藥廠有限公司)、大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、 TTC染色劑(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司)、多聚甲醛、甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水。
1.3大鼠MCAO/R模型制作 大鼠禁食12 h且禁水6 h后,10%的水合氯醛(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉,采用改良MCAO法,將直徑為0.26 mm的線栓預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸浸漬,60℃烘干處理,處理后置入大鼠右側(cè)頸內(nèi)動脈(CA)18~22 mm(根據(jù)動物大小調(diào)整插入線栓的深度),阻塞右側(cè)大腦中動脈,記錄梗阻開始時間,固定外端的線栓縫合皮膚并標記留在皮膚外面線栓。大鼠未蘇醒時注意保暖。缺血2 h后,拔出線栓約10 mm,確保線栓退至頸總動脈分杈處,實現(xiàn)腦缺血再灌注。模型成功的標志:參照Longa等〔8〕的方法,對各組進行神經(jīng)行為學(xué)評分:0分,無神經(jīng)缺損癥狀;1分,不能完全伸展對側(cè)前爪;2分,出現(xiàn)同側(cè)Horner征,行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分,站立不穩(wěn),向?qū)?cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。評分在1~3分的大鼠認為模型制作成功,納入實驗分組。操作過程中出現(xiàn)迷走神經(jīng)損傷、線栓置入失敗或蛛網(wǎng)膜下隙出血、術(shù)后24 h 內(nèi)出現(xiàn)感染的大鼠為造模失敗。造模失敗按照隨機抽樣原則補齊動物并重新造模。
1.4動物分組 隨機將大鼠分為6組:模型組16只,造模后3、6、12、24、48、72 h神經(jīng)評分;內(nèi)眥取血,測血清TNF-α;72 h取腦,其中8只測腦梗死體積比,另外8只測腦含水量。健康對照組16只,除不造模外其他操作同模型組。假手術(shù)組16只,除手術(shù)過程不插線外其他操作同模型組。預(yù)注射組16只,模型制備前0.5 h大鼠皮下注射益賽普0.6 mg/kg。TNF-α干預(yù)組80只,造模后將大鼠隨機分為5個亞組,每組16只。分別為造模后3、6、12、24、48 h組。每組于相應(yīng)時點一次性經(jīng)皮下注射益賽普0.6 mg/kg進行干預(yù)。他汀干預(yù)組80只,分組方式及指標測定同TNF-α干預(yù)組。干預(yù)方式為經(jīng)腹腔注射阿托伐他汀20 mg/kg。
1.5神經(jīng)行為評分 腦缺血再灌注后3、6、12、24、48、72 h分別對各組進行神經(jīng)功能損害評分,評分標準參照Longa等〔8〕的方法,提起鼠尾離開地面33 cm左右,觀察兩前肢的伸展狀況;大鼠置于地面,觀察其行走情況。分數(shù)越高,說明其神經(jīng)行為損傷越重。
1.6梗死范圍的確定 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.30 ml/100 g)〔9〕,斷頭取腦。將腦組織標本置于-20℃冰箱中20 min取出,切去額端1.0 mm,由前向后每隔2.0 mm作冠狀切片,共切5片。放置于1%TTC磷酸緩沖液(0.23 mol/L,pH7.5)中,37.5℃避光孵育,每隔15 min翻面一次,共孵育30 min。正常組織顯示出紅色,梗死組織顯示為白色。染色后數(shù)碼相機拍照,使用ImageJ圖像分析系統(tǒng)計算梗死體積。大鼠腦梗死體積百分比=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側(cè)大腦半球體積〔10〕。
1.7腦組織含水量測定 冰浴中斷頭,取右腦,除去小腦和低位腦干、嗅球,立即用分析天平稱其濕重。置160℃烤箱內(nèi),24 h后稱干重,以計算含水量。公式如下:含水量=(濕重-干重)/濕重×100%〔11〕。
1.8血樣處理及炎癥因子的測定 動物處死前各時點采用眼內(nèi)眥靜脈叢取血,每次取血1~2 ml,室溫靜置2 h左右,將血樣4℃3 000 r/min,離心10 min。分離出血清,置于-80℃冰箱保存。檢測時按試劑盒說明書采用ELISA檢測血清TNF-α。
1.9統(tǒng)計處理 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進行t檢驗,方差分析,單因素方差分析,LSD-t檢驗,Dunnett-T檢驗。
2.1益賽普對腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用 大鼠腦缺血再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h間的TNF-α濃度有統(tǒng)計學(xué)差異(F=44.876,P=0.000),健康對照組、假手術(shù)組、模型組、預(yù)注射組的TNF-α濃度有統(tǒng)計學(xué)差異(F=155.648,P=0.000),健康對照組、假手術(shù)組、模型組、預(yù)注射組的TNF-α濃度隨時點變化規(guī)律不同(F=77.632,P=0.000)。模型組TNF-α造模后迅速升高,于腦缺血再灌注3 h開始顯著高于健康對照組及假手術(shù)組(P<0.01),于24 h達到高峰,隨后開始下降,72 h仍高于假手術(shù)組及健康對照組(P<0.01)。預(yù)注射組與模型組比較,3、6、12、24 h TNF-α的含量顯著降低(P<0.05),見表1。
表1 預(yù)注射對腦缺血再灌注損傷過程中不同時點TNF-α的影響
再灌注72 h,預(yù)注射組神經(jīng)功能評分顯著低于模型組(t=5.938,P<0.01);腦含水量顯著低于模型組,顯著高于健康對照組(F=51.843,P<0.01);梗死體積百分比顯著小于模型組(t=11.502,P<0.01)。見表2。
表2 預(yù)注射對腦缺血再灌注72 h后腦損傷的影響
2.2各時點干預(yù)對腦缺血再灌注后不同時點梗死體積百分比、腦含水量、神經(jīng)功能評分的影響 腦缺血再灌注3、6、12、24 h干預(yù)效果明顯,TNF-α干預(yù)組與他汀干預(yù)組都較模型組腦梗死體積明顯減小(P<0.05),TNF-α干預(yù)組減小腦梗死體積的作用較他汀干預(yù)組更加明顯(P<0.05)。腦缺血再灌注48 h,他汀干預(yù)組與TNF-α干預(yù)組均不能減小梗死灶(P>0.05)。見表3及圖1。3、6、12、24 h TNF-α干預(yù)組與他汀干預(yù)組均較模型組顯著減少腦含水量(P<0.05),TNF-α干預(yù)組效果更明顯(P<0.05),48 h TNF-α干預(yù)組、他汀干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表4。24 h內(nèi) TNF-α干預(yù)組與他汀干預(yù)組均較模型組顯著減少神經(jīng)功能評分(P<0.05),3 h、6 h TNF-α干預(yù)組效果顯著好于他汀干預(yù)組(P<0.05),12、24 h兩干預(yù)組效果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),48 h TNF-α干預(yù)組、他汀干預(yù)組分別與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),見表5??梢姡谀X缺血再灌注24 h內(nèi)TNF-α對腦損傷有促進作用,超過24 h該作用將不再存在,抗TNF-α治療不再有效,因此,抗TNF-α治療越早越好,總體來看,對于減小梗死灶,減輕腦水腫及恢復(fù)神經(jīng)功能,TNF-α干預(yù)效果好于阿托伐他汀。
表3 各時點干預(yù)后腦缺血再灌注各時點梗死體積比較
圖1 各組腦梗死灶TTC染色
表4 各時點干預(yù)后腦缺血再灌注各時點腦含水量的比較
表5 各時點干預(yù)后腦缺血再灌注各時點神經(jīng)功能評分的比較分)
近年來缺血性腦血管病的發(fā)病機制研究取得了很大進展〔12〕。動脈粥樣硬化(AS)是缺血性腦卒中發(fā)病的一個獨立危險因素,研究發(fā)現(xiàn),AS是一個由脂質(zhì)與炎癥共同作用的慢性炎癥性疾病〔13〕,炎癥可通過一系列病理,生理變化促進動脈硬化、硬化斑塊破裂及在此基礎(chǔ)上的血小板聚集、血栓形成,最終導(dǎo)致動脈阻塞。因而,腦缺血早期的炎癥反應(yīng)及其損傷作用日益受到關(guān)注,成為近年研究的熱點〔14〕。TNF-α是由單核巨噬細胞產(chǎn)生的一種肽類激素,是機體抗感染反應(yīng)出現(xiàn)最早和最主要的炎癥因子之一〔15〕,可激活單核/巨噬細胞、中性粒細胞等,增強其吞噬殺傷功能,促進其釋放炎癥蛋白和炎性介質(zhì),是機體免疫炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子〔16〕。TNF-α作為致炎因子除誘發(fā)和促進炎癥以外,還可通過細胞毒性、凝血等反應(yīng)及多種凋亡途徑加劇缺血后損傷〔14〕。本研究采用經(jīng)典的Longa 法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,即通過顱外置入線栓造成大腦中動脈缺血,這是目前研究MCAO-R最常用模型。該模型的主要優(yōu)點是操作成功率高、可重復(fù)性好、并發(fā)癥少、一致性腦梗死效果確實,能夠更好地反映缺血性腦卒中的臨床特點及病理過程〔17〕。本研究結(jié)果提示TNF-α在缺血性腦卒中的發(fā)病機制中起著重要作用。
TNF-α對缺血性腦卒中發(fā)病的促進作用不容忽視。TNF-α是缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)的啟動物質(zhì),是炎性組織中數(shù)量較大的早期介質(zhì)之一,可上調(diào)其他炎癥因子〔如白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8等〕的產(chǎn)生,同時激活招募單核-巨噬細胞,參與AS及缺血性腦損傷形成的全過程。TNF-α也能增加脂質(zhì)信號傳導(dǎo)介質(zhì)如前列腺素和血小板激活因子,這些因子除影響血凝過程外,還可促成血管舒縮因子的下降和內(nèi)皮素(ET)的增加從而引發(fā)血管收縮,增加局部腦卒中的危險性。因而,TNF-α早期的分泌合成與增加是腦梗死形成的主要原因〔18〕,此時下調(diào)炎性因子、阻止炎癥聯(lián)級反應(yīng),將對神經(jīng)細胞具有一定的保護作用〔19〕。本研究進一步驗證了TNF-α在腦缺血再灌注形成中的作用。
急性腦梗死后腦組織局部過度的炎癥反應(yīng)是造成腦損傷的主要原因之一,因此,阻斷腦梗死后的炎癥反應(yīng)是改善梗死后腦損傷的重要手段〔20〕。然而,TNF-α對缺血性腦損傷的作用如何還存在爭議。國內(nèi)多數(shù)研究支持腦缺血后TNF-α的表達具有神經(jīng)毒性。TNF-α 可上調(diào)血管內(nèi)皮細胞和白細胞上的黏附分子的表達,加劇腦內(nèi)炎癥反應(yīng)中性粒細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附作用,阻礙腦組織的供血,損傷局部血管,導(dǎo)致血管通透性增加,促使腦缺血和水腫的發(fā)生,加重缺血性腦組織的損傷〔21〕。陳紅芳等〔22〕報道腦梗死急性期血中TNF-α含量明顯升高,且與ET、一氧化氮(NO)均呈正相關(guān),證實了升高的TNF-α不僅嚴重地破壞了NO-ET軸的正向調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致其失衡狀態(tài),而且促發(fā)和加重了腦梗死程度。TNF-α除了在炎性反應(yīng)啟動和維持中的作用外,也具有終止炎癥的作用〔23〕。有研究認為,腦缺血后2~7 d,TNF-α刺激成纖維細胞、小膠質(zhì)細胞和星形細胞表達神經(jīng)生長因子,這有助于改善缺血狀態(tài)和神經(jīng)元生存。缺血后7~30 d,通過巨噬細胞和膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的絲氨酸激酶、微管蛋白-2激酶等,參與損傷組織吸收、修復(fù)和重塑〔24〕。臨床研究發(fā)現(xiàn),缺血性腦卒中恢復(fù)期TNF-α水平處于較高水平者預(yù)后良好,表明血清TNF-α水平的升高與發(fā)病后腦組織損傷的修復(fù)有關(guān)〔25〕,本研究發(fā)現(xiàn),抗TNF-α干預(yù)在缺血性腦卒中發(fā)生24 h內(nèi)干預(yù)效果顯著,且干預(yù)越早,效果越好,而在缺血再灌注損傷恢復(fù)期尤其48 h 后再施加干預(yù)則無效。由此證實,缺血性腦卒中的不同時程TNF-α發(fā)揮不同作用。急性期表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用,而恢復(fù)期則可能表現(xiàn)為神經(jīng)修復(fù)作用,其修復(fù)作用尚需進一步驗證。在腦損傷早期施加抗TNF-α干預(yù),降低其促炎效應(yīng),可能是今后治療腦缺血的一條新的有效途徑〔19〕。