機(jī)械敏感分子踝蛋白-1在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中表達(dá)和意義

李明軒 鄧麗佳 黨碩 李史恬 阿依木古麗·艾尼 聶永梅 李靜

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1第一臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3第二臨床醫(yī)學(xué)院；4西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)被稱為世界疾病中的頭號(hào)殺手，表現(xiàn)為AS斑塊的出現(xiàn)與發(fā)展。血管內(nèi)皮受到血流的低剪切應(yīng)力從而導(dǎo)致?lián)p傷和修復(fù)的失衡是形成AS斑塊的原因〔1〕。脈管系統(tǒng)在層流低剪切應(yīng)力作用下會(huì)使巨噬細(xì)胞和血小板在血管內(nèi)膜浸潤、泡沫細(xì)胞形成、斑塊產(chǎn)生等一系列AS標(biāo)志性進(jìn)程發(fā)生〔1〕。踝蛋白(Talin)作為一種結(jié)合并激活整合素的細(xì)胞骨架蛋白，通過連接肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和膜整合素，將來自胞外的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，這一過程稱為機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)〔2，3〕。Talin-1在血流剪切應(yīng)力的誘導(dǎo)下發(fā)生機(jī)械解折疊會(huì)暴露新的識(shí)別位點(diǎn)，從而募集并結(jié)合參與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白，形成穩(wěn)定的黏附復(fù)合物，以此影響AS斑塊的病理進(jìn)程〔4〕。本研究主要分析Talin-1與AS小鼠血清脂質(zhì)參數(shù)之間的相關(guān)性，探討Talin-1在AS發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為AS早期診斷分子標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1材料 Talin-1兔抗小鼠多克隆抗體(abcam，USA)，熒光素5-異硫氰酸酯(FITC)熒光素標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(AiMeijie Technology，武漢)，全自動(dòng)生化分析儀(BK-360)；冰凍切片包埋劑(OCT，SAKURA，JPN)；冰凍切片機(jī)(Leica-1520)；熒光抗淬滅劑及細(xì)胞核染色劑(DAPI，Thermo Fisher，US)；小鼠Talin-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(MyBioSouce，USA)。

1.2動(dòng)物模型的建立與取材 購自北京華阜康生物科技有限公司C57BL/6J ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠各8只，雄性，6周齡，體重(20±2)g，所有小鼠均于SPF環(huán)境飼養(yǎng)，溫度20℃～25℃，濕度50%～60%，每天光照12 h，使用含21%脂肪，34%蔗糖，0.15%膽固醇的西方飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組野生型小鼠給予正常飼料，飼養(yǎng)8 w以復(fù)制早期AS動(dòng)物模型。

兩組小鼠定期稱重，于飼養(yǎng)8周末，將各組小鼠禁食12 h，腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉后于眼窩靜脈叢取血約700 μl，靜置30 min，離心10 min(3 000 r/min)取血清，分別于-80℃?zhèn)溆?。固定小鼠，沿頸部中線做切口，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液灌注心臟以沖凈血液，游離出主動(dòng)脈根部至升胸主動(dòng)脈部分的血管，4%多聚甲醛固定12 h后沉糖，OCT包埋，-80℃環(huán)境保存。

1.3血脂測定 全自動(dòng)生化分析儀檢測脂質(zhì)參數(shù)總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.4病理組織形態(tài)檢測 將OCT包埋的組織于-20℃恒溫環(huán)境下，采取橫斷面連續(xù)切片的方法，行蘇木素-伊紅(HE)染色判斷AS發(fā)生發(fā)展的程度，光鏡下觀察并采圖。

1.5免疫熒光法 冰凍切片(6 μm)用4%的多聚甲醛固定15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液避光封閉1 h；滴加足量兔抗鼠的Talin-1多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過夜；去除多余液體后添加FITC熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶50)，室溫孵育2 h；滴加含DAPI的抗淬滅劑；熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。熒光強(qiáng)度半定量分析使用Image Pro Plus 6.0軟件完成。

1.6ELISA檢測可溶性Talin-1(sTalin-1)表達(dá) 按照小鼠Talin-1 ELISA試劑盒說明書，將樣品 OD值轉(zhuǎn)化為濃度(ng/ml)，并運(yùn)用CurveExpert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(r=0.9997)，測定血清sTalin-1表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠血脂檢測 實(shí)驗(yàn)組TC、TG、LDL-C、HDL-C顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量對(duì)比

2.2病理學(xué)形態(tài)觀察 對(duì)照組血管管腔結(jié)構(gòu)清晰，具有明顯的內(nèi)膜、中膜和外膜結(jié)構(gòu)；血管內(nèi)皮完整，無炎性細(xì)胞浸潤，無脂質(zhì)聚積。實(shí)驗(yàn)組則出現(xiàn)典型的血管壁增厚，部分內(nèi)膜破損，炎性細(xì)胞浸潤，彈性纖維破壞，內(nèi)膜表面有纖維組織的增生，部分血管腔出現(xiàn)AS斑塊，管腔狹窄，結(jié)合血脂四項(xiàng)參數(shù)分析，AS小鼠模型建立成功。見圖1。

圖1 主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈根部HE染色(×40)

2.3免疫熒光檢測病灶組織中Talin-1的表達(dá) FITC標(biāo)記的Talin-1為綠色熒光，DAPI染色的細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，Talin-1在實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈根部內(nèi)膜和中膜呈陽性表達(dá)，對(duì)照組主動(dòng)脈組織中Talin-1表達(dá)陽性的細(xì)胞浸潤較少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、表2。

圖2 免疫熒光檢測Talin-1的表達(dá)(×100)

2.4各組血清中sTalin-1的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組血清sTalin-1顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。相關(guān)性分析顯示sTalin-1與TC(r=0.987，P<0.001)、TG(r=0.928，P=0.001)、LDL-C(r=0.984，P<0.001)呈正相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與HDL-C無顯著相關(guān)性(r=0.720，P=0.066)。

表2 Talin-1在主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈根部及血清中sTalin-1的表達(dá)

3 討 論

AS的發(fā)生是大多數(shù)心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，臨床心血管疾病首先出現(xiàn)癥狀通常是在AS斑塊已經(jīng)成型并發(fā)展為中后期的階段，而從動(dòng)脈壁發(fā)生異常到出現(xiàn)臨床癥狀一般需要經(jīng)過數(shù)十年甚至更長的亞臨床期，僅僅通過經(jīng)典的危險(xiǎn)因素和評(píng)分量表(如Framingham風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分)來估計(jì)AS和心血管事件的進(jìn)展是不充分的，而疾病的分子標(biāo)記物可以迅速、準(zhǔn)確的篩查疾病的發(fā)生發(fā)展，具有重要臨床意義。

目前對(duì)于AS標(biāo)志物的研究主要集中于早期及臨床前期的動(dòng)脈壁改變標(biāo)志物和循環(huán)標(biāo)志物。對(duì)于動(dòng)脈壁的形態(tài)改變可以通過高分辨率B超來測量內(nèi)膜中層厚度(IMT)，IMT的測量作為一種直觀并且可量化AS危險(xiǎn)程度的方法成為早期AS的確診標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)心血管風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的首選方法之一〔5〕，然而目前對(duì)于IMT的測量方法及如何在正常組織和病理組織之間設(shè)定精確的IMT閾值仍存在較大爭議。研究表明，超敏C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)可以誘導(dǎo)組織因子的表達(dá)、激活補(bǔ)體、介導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移和巨噬細(xì)胞對(duì)LDL的攝取，整合總體細(xì)胞因子下游的信號(hào)通路，對(duì)血管疾病的進(jìn)展有著直接作用，因此hsCRP被認(rèn)為是最有希望的循環(huán)標(biāo)志物〔6〕。然而，通過22項(xiàng)前瞻性研究的多元分析發(fā)現(xiàn)，在平衡其他危險(xiǎn)因素后，hsCRP對(duì)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的價(jià)值低于預(yù)期〔7〕。但有研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞加載低剪切應(yīng)力將導(dǎo)致部分區(qū)域內(nèi)皮功能障礙〔1〕，并形成大量細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組成的AS微環(huán)境〔8〕，雖然AS毫無疑問是由脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的炎性病理過程，但在血脂水平正常的情況下，AS微環(huán)境也可以通過整合素來調(diào)節(jié)斑塊發(fā)生位置，并增加AS相關(guān)細(xì)胞在血流應(yīng)力刺激下的敏感性〔9〕。

整合素已被證實(shí)作為重要的細(xì)胞膜表面機(jī)械信號(hào)感受器，在AS微環(huán)境中發(fā)揮重要作用〔10，11〕。事實(shí)上，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)AS斑塊和動(dòng)脈外膜中整合素表達(dá)上調(diào)，并與IMT有著強(qiáng)相關(guān)性，提出將整合素作為AS的分子標(biāo)志物〔12〕。由于整合素不具備激酶活性，故需要通過募集Talin-1等細(xì)胞骨架蛋白形成黏著斑來維持整合素與肌動(dòng)蛋白絲的穩(wěn)定性，通過拉伸細(xì)胞外基質(zhì)和增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)球蛋白收縮力，來增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白絲束，從而快速建立黏附位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)AS相關(guān)細(xì)胞的遷移、黏附能力〔13〕。而Talin-1作為整合素從被激活到高親和力構(gòu)象改變這一過程的重要標(biāo)志〔14〕，也是形成黏著斑的重要結(jié)構(gòu)蛋白，其大小為270 kD(包含2 541個(gè)氨基酸)〔15〕。Talin-1分子包含位于N端的兩個(gè)整合素結(jié)合位點(diǎn)和位于C端的三個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合域(ABDs)，其N端頭部可以結(jié)合整合素亞單位近膜端，誘導(dǎo)整合素發(fā)生構(gòu)象變化并激活整合素〔16〕。C端也能與整合素β鏈、肌動(dòng)蛋白、紐蛋白相結(jié)合，以此來為蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝提供支架〔17〕。Talin與整合素的連接以一種“橋梁”的作用機(jī)械耦聯(lián)細(xì)胞與周圍環(huán)境，將來自AS微環(huán)境的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)化學(xué)信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移等生物學(xué)行為。

Talin對(duì)整合素的激活至關(guān)重要。Talin基因的敲除可以導(dǎo)致整合素?zé)o法活化及啟動(dòng)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，中國倉鼠卵巢細(xì)胞模型是研究Talin與整合素作用機(jī)制中普遍被接受的模型，其中Talin可以與整合素的β3尾部結(jié)合并激活整合素從而促進(jìn)卵巢細(xì)胞的增殖遷移〔18〕。Chinthalapudi等〔19〕使用Talin-1-/-卵巢細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)黏著斑的形成和整合素的激活都被抑制，而向細(xì)胞內(nèi)引入Talin-1基因則可以恢復(fù)整合素的活化，并使下游的生理反應(yīng)正常進(jìn)行〔20〕。Kopp等〔21〕發(fā)現(xiàn)，敲低Talin-1在內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移等生物學(xué)行為中起到負(fù)性調(diào)控的作用。由此推測，Talin-1作為一種細(xì)胞骨架蛋白與細(xì)胞的增殖、遷移、黏附、侵襲及AS的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)?；赥alin-1獨(dú)特的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)特性賦予了癌細(xì)胞增殖、擴(kuò)散的能力，sTalin-1與甲胎蛋白(AFP)等傳統(tǒng)標(biāo)記物進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，sTalin-1具有更高的特異性和敏感性，可以作為前列腺癌〔22〕、鼻咽癌〔23〕、肝癌〔24〕的新型生物標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)使用高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠8 w的方法來構(gòu)建早期AS動(dòng)物模型〔25〕，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用免疫熒光在組織學(xué)水平對(duì)Talin-1的含量進(jìn)行定量和定位檢測，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Talin-1在血管病灶中表達(dá)上調(diào)，然而Von等〔26〕檢測了來自坦佩雷大學(xué)血管研究所(TVS)的動(dòng)脈粥樣硬化樣本發(fā)現(xiàn)，Talin-1在粥樣斑塊中的表達(dá)低于健康血管，推測可能是由于TVS樣本均為AS晚期，與本實(shí)驗(yàn)所用的AS早期模型不同，參與組成斑塊的細(xì)胞成分發(fā)生巨大改變，因此造成了早期AS血管病灶中Talin-1的表達(dá)較高，而晚期AS血管病灶中Talin-1表達(dá)降低的結(jié)果，但其中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。

本實(shí)驗(yàn)ELISA檢測結(jié)果表明Talin-1可能與AS的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，相關(guān)分析顯示sTalin-1與血脂參數(shù)的水平變化存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這種相關(guān)性有可能在AS斑塊形成的病理過程中起到重要作用，通過測定sTalin-1對(duì)于判斷AS患者的病情有一定的臨床意義。

綜上，Talin-1表達(dá)上調(diào)可能是斑塊最初形成的觸發(fā)因素之一，引起這種上調(diào)的原因可能由外部因素引起，如剪切應(yīng)力改變及血壓升高，導(dǎo)致參與組成AS微環(huán)境的細(xì)胞發(fā)生改變。另外，推測基因?qū)用嬉部赡軐?dǎo)致AS斑塊中Talin-1上調(diào)。研究表明，機(jī)械傳感和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)影響DNA的包裝和蛋白質(zhì)組成的變化，基因突致使人群中AS的易感性升高〔27〕。sTalin-1參與組成機(jī)械信號(hào)感受器，可能在AS斑塊的形成和疾病的進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用，具有成為早期AS循環(huán)標(biāo)志物的潛力，也為AS的早期確診奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。