RNA干擾COMMD8基因表達(dá)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌凋亡和增加順鉑敏感性

楊穎 汪銳 成薇婷

(武漢市第一醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，湖北 武漢 430000)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，每年大約180萬(wàn)人被診斷為肺癌，160萬(wàn)人死于肺癌，患者5年生存期為4%～17%〔1〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%，靶向治療是其主要的治療方式，但患者逐漸顯現(xiàn)的耐藥性是臨床治療的主要障礙〔2〕。研究肺癌發(fā)展的分子機(jī)制，為其提供新的治療靶點(diǎn)或抑制劑可有效改善患者生存期。研究表明，銅代謝MURR1結(jié)構(gòu)域(COMMD)8在NSCLC中高表達(dá)，參與LINC00657靶向miR-26b-5p/COMMD8信號(hào)通路，可促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展〔3〕，但其具體作用機(jī)制尚未明確。COMMD8在肝癌中也表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔4〕。本課題以肺癌細(xì)胞H1299為主要研究對(duì)象，假設(shè)轉(zhuǎn)染si-COMMD8可抑制肺癌增殖、遷移和侵襲和促進(jìn)凋亡，增強(qiáng)其順鉑敏感性，并對(duì)此假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為肺癌治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B和人肺癌細(xì)胞株H1299、SPC-A-1、H446購(gòu)自ATCC；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PI3K/Akt信號(hào)通路通路激動(dòng)劑胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1(HPLC≥98%)購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；順鉑(DDP)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；COMMD8 RNA干擾劑(si-COMMD8)和陰性對(duì)照si-con購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNA提取試劑Trizol、 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；COMMD8抗體、Ki-67抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、多藥耐藥基因(MDR)1抗體、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、p-PI3K抗體、p-AKT抗體和β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；CCK-8試劑盒及二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中，將肺癌細(xì)胞H1299、SPC-A-1和H446培養(yǎng)在含10 % FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液中均添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，洗滌消化傳代。

1.2.2Real-time PCR檢測(cè)COMMD8 mRNA的表達(dá) 收集培養(yǎng)好的BEAS-2B、H1299、SPC-A-1和H446細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢測(cè)cDNA的濃度和純度，置于-80℃保存。以cDNA為模板按照實(shí)時(shí)熒光PCR的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，合成COMMD8 mRNA。引物如下：COMMD8上游引物：5′-TGTGGTCGAGCTTATCCTGTG-3′，下游： 5′-GTGCAAGCTTTACCTGCCAA-3′。運(yùn)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)好的BEAS-2B、H1299、SPC-A-1和H446細(xì)胞，或轉(zhuǎn)染si-COMMD8后的H1299細(xì)胞，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，收集蛋白并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(COMMD8抗體1∶1 000、Ki-67抗體1∶1 000、MMP-2抗體1∶3 000、MDR1抗體1∶1 000、酶切caspase-3抗體1∶2 000、p-PI3K抗體1∶1 000、p-AKT抗體1∶1 000和β-actin抗體1∶3 000)，4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗膜3次，然后加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h，顯色，拍照。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將H1299細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染si-COMMD8，以轉(zhuǎn)染si-con為對(duì)照。轉(zhuǎn)染分組：空白(NC)組(不轉(zhuǎn)染)，對(duì)照(轉(zhuǎn)染si-con)組和si-COMMD8(轉(zhuǎn)染si-COMMD8)組。si-COMMD8試驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染si-COMMD8的H1299細(xì)胞)、si-COMMD8+IGF-1(轉(zhuǎn)染si-COMMD8后用100 ng/ml IGF-1培養(yǎng)48 h)、si-COMMD8+PBS(轉(zhuǎn)染si-COMMD8加入與IGF-1等量的PBS進(jìn)行培養(yǎng)48 h)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。轉(zhuǎn)染成功后用100 ng/ml P13K/Akt信號(hào)通路激動(dòng)劑IGF-1培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.2.5Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染si-COMMD8 后的H1299細(xì)胞，將細(xì)胞洗滌2次，加入RIPA裂解液重懸細(xì)胞，室溫裂解細(xì)胞20 min，冰浴超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度。每個(gè)樣本取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗〔COMMD8抗體1∶1 000、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體1∶3 000、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體1∶2 000和β-actin抗體1∶4 000〕，4℃孵育過(guò)夜，洗膜3次后加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h，顯色，拍照。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.6CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 將轉(zhuǎn)染后或(和)IGF-1處理過(guò)的H1299細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化后將細(xì)胞稀釋為2×104個(gè)/ml，以2×103個(gè)/孔(100 μl細(xì)胞)接種于96微孔板中，加入10 μl CCK-8液體，將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率%=試驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值%。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移和侵襲數(shù) 遷移實(shí)驗(yàn)：將1.2.5分組的各組H1299細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集并消化細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋為1×106個(gè)/ml，Transwell上層小室中加入100 μl細(xì)胞，,下層培養(yǎng)孔加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，取出用棉簽拭去上層小室內(nèi)層未遷移的細(xì)胞，冰甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，然后顯微鏡取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，取平均值。

侵襲實(shí)驗(yàn)：將液化的基質(zhì)膠以1∶4比例用4℃無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，稀釋后取100 μl加入上層Transwell小室，使其平鋪入上層小室，37℃放置3～5 h使其固態(tài)化，以下步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，上層加入100 μl細(xì)胞，下層加入無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，固定細(xì)胞，染色，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將1.2.5分組的各組H1299細(xì)胞收集并進(jìn)行消化，取2×104個(gè)細(xì)胞置于離心管內(nèi)，根據(jù)凋亡試劑盒的說(shuō)明用200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光10～20 min，上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1COMMD8基因在人正常肺上皮細(xì)胞株和肺癌細(xì)胞中的表達(dá) 肺癌H446、SPC-A-1和H1299細(xì)胞中COMMD8 mRNA和蛋白水平均顯著高于BEAS-2B組(均P<0.05)，見(jiàn)圖1和表1。選取表達(dá)差異較大的H1299細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 檢測(cè)人正常肺上皮細(xì)胞株和肺癌細(xì)胞中COMMD8 mRNA和蛋白的表達(dá)

2.2沉默COMMD8基因抑制細(xì)胞存活和細(xì)胞遷移侵襲 NC組和si-con組COMMD8、Ki-67、MMP-2、細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與si-con組和NC組相比，si-COMMD8組COMMD8、Ki-67和MMP-2蛋白含量均

顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表2。說(shuō)明沉默COMMD8可抑制Ki-67和MMP-2蛋白表達(dá)，抑制H1299細(xì)胞存活、遷移和侵襲。

1～4：BEAS-2B組，SPC-A-1組，SPC-A-1組，H1299組圖1 Western印跡檢測(cè)人正常肺上皮細(xì)胞株和肺癌細(xì)胞中COMMD8蛋白的表達(dá)

表2 沉默COMMD8基因抑制細(xì)胞存活和細(xì)胞遷移侵襲及Ki-67、MMP-2蛋白的表達(dá)

2.3沉默COMMD8基因誘導(dǎo)增加DDP敏感性 NC組和si-con組酶切caspase-3、MDR1、DDP及凋亡率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與si-con組和NC組相比，si-COMMD8組酶切caspase-3含量顯著升高(P<0.05)，MDR1蛋白含量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，DDP對(duì)H1299的IC50值顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3，圖4，表3。說(shuō)明沉默COMMD8可誘導(dǎo)H1299細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞的DDP敏感性。

1～3：NC組，si-con組,si-COMMD8組圖3 Western印跡檢測(cè)酶切caspase-3和MDR1蛋白的表達(dá)

表3 沉默COMMD8基因?qū)Φ蛲?、DDP敏感性及酶切caspase-3、MDR1蛋白表達(dá)的影響

2.4沉默COMMD8基因影響PI3K/AKT信號(hào)通路 NC組和si-con組p-PI3K和p-Akt蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與si-con組和NC組相比，si-COMMD8組p-PI3K和p-AKT蛋白含量均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5和表4。說(shuō)明沉默COMMD8可抑制H1299細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)通路。

圖5 Western印跡檢測(cè)p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)

表4 沉默COMMD8基因抑制PI3K/AKT信號(hào)通路

2.5IGF-1部分逆轉(zhuǎn)沉默COMMD8基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞P13K/Akt信號(hào)通路、增殖和遷移侵襲的影響 與si-COMMD8+PBS組相比，si-COMMD8+IGF-1組，p-PI3K和p-AKT含量均顯著升高(P<0.05)，COMMD8、Ki-67和MMP-2蛋白的表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6和表5。說(shuō)明IGF-1可逆轉(zhuǎn)沉默COMMD8對(duì)H1299細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路、增殖和遷移侵襲的影響。

1，2：si-COMMD8+PBS組,si-COMMD8+IGF-1組圖6 Western印跡檢測(cè)COMMD8、Ki-67、MMP-2、p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)

表5 IGF-1可逆轉(zhuǎn)沉默COMMD8基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路及增殖和遷移侵襲的影響

2.6IGF-1部分逆轉(zhuǎn)沉默COMMD8基因?qū)13K/Akt信號(hào)通路、增殖和遷移侵襲的影響 與si-COMMD8+PBS組相比，si-COMMD8+IGF-1組酶切caspase-3含量顯著降低(P<0.05)，MDR1蛋白含量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，DDP對(duì)H1299的IC50值顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖7，圖8，表6。說(shuō)明IGF-1可逆轉(zhuǎn)沉默COMMD8對(duì)H1299細(xì)胞凋亡和DDP敏感性的影響。

表6 IGF-1可逆轉(zhuǎn)沉默COMMD8基因?qū)Φ蛲龊虳DP敏感性的影響

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)同時(shí)沉默IGF-1和COMMD8后肺癌細(xì)胞凋亡

1，2：si-COMMD8+PBS組，si-COMMD8+IGF-1組圖7 Western印跡檢測(cè)酶切caspase-3和MDR1蛋白的表達(dá)

3 討 論

COMMD8是COMMD家族成員之一，COMMD家族的10個(gè)成員(COMMD1～COMMD10)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，含有一個(gè)70～80個(gè)氨基酸的高度保守的C末端序列，稱為COMM結(jié)構(gòu)域；COMMD家族成員在人多種組織中廣泛表達(dá)，可能參與銅的代謝，它們彼此形成低聚物復(fù)合物，該復(fù)合物定位于體內(nèi)隔室并介導(dǎo)幾個(gè)跨膜貨物的運(yùn)輸〔5〕，COMMD蛋白可能通過(guò)促進(jìn)核因子(NF)-κB亞基與連接酶的結(jié)合參與泛素化途徑，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮更廣泛的作用〔6〕。COMMD蛋白在血漿脂蛋白水平和動(dòng)脈粥樣硬化的形成中也發(fā)揮重要作用〔7〕，而其表達(dá)失調(diào)也與多種疾病和癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。研究表明，COMMD8在NSCLC中表達(dá)上調(diào)，LncRNA LINC00657通過(guò)靶向miR-26b-5p/COMMD8 促進(jìn)肺癌的進(jìn)展〔3〕，說(shuō)明COMMD8在肺癌的發(fā)展中具有重要作用，可能是肺癌的潛在分子靶點(diǎn)。

NSCLC患者通常發(fā)生基因突變和癌基因的過(guò)度表達(dá)，利用突變基因和癌基因的siRNA進(jìn)行靶向治療是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的腫瘤治療策略，它通過(guò)特異性靶向抑制與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的抑制作用〔8〕。Mao等〔9〕研究表明，在肺癌A549和H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-TMEM98能有效抑制A549和H460細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、RhoC和MTA1均受到顯著調(diào)節(jié)。He等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6在人肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，siRNA誘導(dǎo)的人肺癌SPC-A1細(xì)胞中TRAF6基因敲除可抑制癌細(xì)胞侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，動(dòng)粒相關(guān)蛋白(KNTC)2在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包裹在脂質(zhì)納米粒(KNTC2-LNP)中KNTC2 siRNA在原位肝細(xì)胞癌異種移植小鼠模型體內(nèi)具有抗腫瘤活性，在肺癌異種移植瘤皮下模型中也具有抗腫瘤活性，抑制腫瘤生長(zhǎng)〔11〕。本研究結(jié)果說(shuō)明在肺癌H1299細(xì)胞中RNA干擾COMMD8具有抑制肺癌提高DDP敏感性的作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、存活、運(yùn)動(dòng)、侵襲和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等，此通路調(diào)控的失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，也與NSCLC患者對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療的抵抗和較低的生存率有關(guān)〔12〕。PI3K/AKT/mTOR通路在癌癥中通常是異常激活狀態(tài)，是攜帶EGFR激活突變的肺腺癌患者獲得性抵抗EGFR-TK抑制劑的機(jī)制之一，PI3K通路的幾種抑制劑正在臨床前和臨床研究中進(jìn)行評(píng)估〔13〕。PI3K抑制劑的早期臨床研究已經(jīng)證明了初步的抗腫瘤活性和可接受的安全性〔14〕；靶向AKT也是腫瘤靶向治療的一個(gè)有效途徑〔15〕。本研究結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)染si-COMMD8 可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路激動(dòng)劑IGF-1處理可逆轉(zhuǎn)沉默COMMD8對(duì)H1299細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路、增殖、遷移、侵襲、凋亡及DDP敏感性的影響。