吉林漢族骨關(guān)節(jié)炎患者與KIR及配體關(guān)聯(lián)性

韓瑜 葉壯 楊帆 張晶瑩 趙令 于江虹 焦立新

(1長(zhǎng)春市中心血站輸血研究所，吉林 長(zhǎng)春 130000；2吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；3吉林省疾病預(yù)防控制中心)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是人體能動(dòng)關(guān)節(jié)的一種退行性疾病，老年人多見(jiàn)，以關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限等為主要臨床癥狀〔1〕。OA的確切病因未明，以前只是簡(jiǎn)單地認(rèn)為OA是由于關(guān)節(jié)磨損而受到的損害，而現(xiàn)在一致認(rèn)為OA是由局部和系統(tǒng)因素的復(fù)雜作用而造成的〔2〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，OA患者外周血及滑液中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量變化顯著，Th17和Th1/17細(xì)胞數(shù)增多。這說(shuō)明在OA患者滑膜腔中有免疫細(xì)胞的激活〔3〕，免疫因素可能在OA的發(fā)生中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。自然殺傷(NK)細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞，在天然免疫方面起著重要的作用。NK細(xì)胞功能的發(fā)揮主要依賴(lài)于殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)，它通過(guò)與靶細(xì)胞表面相應(yīng)的人白細(xì)胞抗原(HLA)Ⅰ類(lèi)分子結(jié)合，傳導(dǎo)激活或抑制信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞活性，在造血干細(xì)胞移植、母胎耐受、抗感染免疫及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔4〕。在以往實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)吉林地區(qū)的漢族健康人群的KIR及配體的多態(tài)性進(jìn)行了分析〔5〕，本研究采用PCR-SSP的方法繼續(xù)對(duì)吉林地區(qū)的OA患者進(jìn)行KIR及HLA配體復(fù)合體分型，分析并探討免疫因素在OA發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1試劑與儀器 DNA提取試劑盒(批號(hào)：20081410T146，西安天隆科技有限公司)；核酸自動(dòng)化提取系統(tǒng)(EZBead system-32，美國(guó)TBG)；凝膠成像分析系統(tǒng)(JY04S-3C，北京君意東方)；超微量微孔板分光光度計(jì)(Epoch，美國(guó)Bio-Tek公司)。

1.2研究對(duì)象 ①OA組：采集2019年1月至2020年2月吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門(mén)診及住院OA患者135例。男48例，女87例，平均年齡(62.53±5.88)歲。臨床診斷OA患者，均符合2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)關(guān)節(jié)外科學(xué)組《骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，排除合并類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或其他骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病病史的患者。②正常對(duì)照組：選取同期來(lái)自體檢中心年齡相當(dāng)?shù)?40名健康體檢者作為正常對(duì)照組，男45例，女95例，平均年齡(61.77±6.56)歲，均簽署知情同意書(shū)。OA組與正常對(duì)照組年齡、性別等一般資料方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。征其同意后抽取2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血，凍存于-80℃冰箱備用。

1.3基因組DNA提取 采用全血基因組核酸提取試劑盒，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，使用核酸自動(dòng)化提取系統(tǒng)提取基因組DNA。DNA 濃度20～100 ng/μl，A260/A280 為1.7～2.0。

1.4基因分型 KIR基因及HLA配體基因的檢測(cè)采用PCR-SSP方法，引物序列、PCR體系和循環(huán)條件參照文獻(xiàn)〔7，8〕。取 10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于2%瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE 緩沖液中，10 V/cm 電泳 20 min，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.5KIR與HLA配體頻率計(jì)算 參照文獻(xiàn)〔9〕方法通過(guò)直接計(jì)數(shù)計(jì)算，頻率(%)=陽(yáng)性基因數(shù)/研究組總?cè)藬?shù)；KIR/HLA 配體復(fù)合體的出現(xiàn)頻率按照如下受配體的識(shí)別方式進(jìn)行：KIR2DL1+HLA-C2，KIR2DL2/3+HLA-C1，KIR2DS1+HLA-C2，KIR2DS2+HLA-C1和KIR3DS1+ HLA-Bw4(HLA-A Bw4，HLA-B Bw4T，HLA-B Bw4I)，KIR3DL1+HLA-Bw4(HLA-A Bw4，HLA-B Bw4T，HLA-B Bw4I)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1KIR基因及HLA配體電泳結(jié)果 目的片段大小均與預(yù)期結(jié)果相符(圖1、2)。

M：Marker; 1～12：2DL4_B,3DL2_A,3DL3_B；2DS2_B,3DP1；2DP1_A,2DS2_A；3DL3A,2DS5_B,3DL2_B；2DS4_B,2DS5_A；2DS4_A,3DL1_B,2DL1_A；2DL3_A,2DS3_A,3DS1_B；2DL3_B,2DL4_A；2DL5_A,2DL5_B,2DS1；3DL1_A,3DS1_A,DRB1；2DS3_B,2DP1_B；2DL1_B,2DL2_A,2DL2_B圖1 KIR 基因的 PCR-SSP 分型結(jié)果

M：Marker；1～5：HLA-A Bw4，HLA-B Bw4I,HLA-B Bw4T,HLA-C2,HLA-C1圖2 HLA配體的 PCR-SSP 分型結(jié)果

2.2吉林地區(qū)OA組和對(duì)照組KIR基因頻率 OA患者中框架基因KIR3DL2、KIR3DL3和KIR2DP1頻率為100%。OA患者中KIR2DL2、KIR2DL5和KIR2DS1基因頻率分別是27.41%、42.96%、41.48%，顯著高于正常對(duì)照組的16.43%、30%、29.29%(P<0.05)。其余兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 吉林地區(qū)OA組和正常對(duì)照組KIR基因頻率比較〔n(%)〕

2.3吉林地區(qū)OA組和正常對(duì)照組HLA配體頻率比較 表2可見(jiàn)，正常對(duì)照組HLA-A Bw4的基因頻率顯著高于OA組(P<0.05)。其余HLA配體的基因在正常對(duì)照組和OA組中出現(xiàn)頻率較為相近，差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 吉林地區(qū)OA組和正常對(duì)照組HLA配體頻率比較〔n(%)〕

2.4吉林地區(qū)OA組和正常對(duì)照組KIR/HLA受配體組合比較 由表3可見(jiàn)，KIR3DL1+HLA-Bw4在正常對(duì)照組的頻率顯著高于OA組(P<0.05)。KIR3DL1+HLA-A Bw4在正常對(duì)照組的頻率，顯著高于OA組(P<0.05)。而其他指標(biāo)兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 吉林地區(qū)OA組和正常對(duì)照組KIR/HLA受配體組合比較〔n(%)〕

3 討 論

OA一直以來(lái)被認(rèn)為是衰老過(guò)程中不可避免的現(xiàn)象，直到近期，才明確OA為一種獨(dú)立的疾病，是一種與多種因素相關(guān)的，發(fā)生在多關(guān)節(jié)部位的退行性病變。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在60歲以上的老年人當(dāng)中膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病率，男性為9.6%；女性高達(dá)18%〔10〕，但是OA的發(fā)病機(jī)制仍然不清，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

KIR的配體主要為HLA-Ⅰ類(lèi)抗原，不同的KIR受體識(shí)別不同人類(lèi)經(jīng)典MHC-I分子HLA-A，-B和-C〔11〕，并進(jìn)一步判別對(duì)象屬于“自我”或“非我”，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，在自身免疫性疾病〔12〕、癌癥〔13〕、傳染病〔14〕和移植〔15〕等方面，KIR基因多態(tài)性越來(lái)越受到人們的關(guān)注。大量文獻(xiàn)報(bào)道KIR基因多態(tài)性與多種自身免疫病相關(guān)。Yen等〔16〕報(bào)道在類(lèi)風(fēng)濕血管炎和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，KIR2DS1的頻率顯著升高；Jiao等〔17〕報(bào)道HLA-B27陽(yáng)性患者與HLA-B27陽(yáng)性對(duì)照組比較，KIR2DL1與KIR2DL5基因頻率較高，KIR2DL5基因的頻率高于對(duì)照組，同時(shí)HLA-Cw*08基因頻率也顯著升高。以上研究顯示，在自身免疫性疾病中存在抑制型KIR基因頻率降低，或(和)活化型KIR基因頻率增高的情況。

本研究發(fā)現(xiàn)OA患者中抑制型KIR2DL2和KIR2DL5基因頻率升高，而活化型KIR2DS1基因頻率也升高，可能因?yàn)榛蝾l率的變化導(dǎo)致NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞抑制型受體和激活型受體之間的平衡受到破壞從而使其活化的域值降低，激活了NK細(xì)胞；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)OA組中HLA-A Bw4的基因頻率低于正常對(duì)照組，可能由于OA組KIR配體HLA-A Bw4基因水平降低從而使得HLA-A Bw4分子表達(dá)下調(diào)，激活了NK細(xì)胞；或KIR3DL1+HLA-A Bw4減少，KIR對(duì)NK細(xì)胞的抑制性減弱，相應(yīng)的激活型受體增加，從而引起了OA的發(fā)生和發(fā)展。

當(dāng)然，KIR及配體與OA的關(guān)聯(lián)性，還需要進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行證實(shí)，本研究只是進(jìn)行了一個(gè)初步的探討?？傊琄IR作為一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要的作用，隨著我們對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能的深入研究，必將會(huì)為臨床治療提供新的免疫靶點(diǎn)。