板藍根花葉病病原分子鑒定△

魏若凡，王蓉，李勇，丁萬隆

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

板藍根Isatidis Radix 是十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥根，具有清熱解毒、清涼利咽之功效[1]。近年來，板藍根病毒病頻發(fā)，成為影響板藍根產量和藥用品質的重要病害。2020 年9 月，在對安徽省太和縣板藍根進行病害調查時發(fā)現(xiàn)板藍根花葉病，其癥狀表現(xiàn)為葉片皺縮、花葉，根系變小，病害發(fā)生率為5%～10%。目前，已鑒定出板藍根花葉病的病原包括黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和蠶豆萎蔫病毒2 號（broad bean mosaic virus 2，BBWV2）[2-3]。另外，馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus）也是引起花葉病的一類重要病原，可能造成板藍根花葉病[4]1069。通過對病毒外殼蛋白（coat protein，CP）基因進行序列測定、BLASTn 分析和系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建，分析病毒的序列特征和分類地位，為板藍根花葉病的監(jiān)測和防控提供參考。

1 材料

1.1 樣品

板藍根花葉病病葉于2020 年9 月采集自安徽省太和縣（N33°30′54″，E115°31′28″，海拔40 m），葉片呈現(xiàn)黃綠相間的花葉癥狀并出現(xiàn)皺縮（圖1），由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所王蓉副研究員鑒定為板藍根花葉病病葉，編號為BLG1～BLG5。

圖1 板藍根花葉病田間癥狀

1.2 試藥

TRNzol（批號：R6801）、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑（批號：U8908）、質粒小提試劑盒（批號：U8904）均購自天根生化科技（北京）有限公司；M-MLV 反轉錄酶（批號：AG70412A，北京拜爾迪生物技術有限公司）；pMD19-T Vector（批號：AHF1958A）、T4 DNA Lingas（批號：AKE2060A）、Ex TaqDNA polymerase（批 號：AJE0795A）、RNase Inhibitor（批號：AH40401A）均購自大連寶生物股份有限公司；dNTPs（批號：N10219）、random hexamers primer（批號：K31126）、Oligo（dT）18（批號：K20608）、大腸桿菌DH-5α 感受態(tài)細胞（批號：N1290610）均購自北京全式金生物技術有限公司。引物合成和序列測定由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3 儀器

Fresco 21 型冷凍高速離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；Research plus 型移液器（Eppendorf 公司）；T100 型基因擴增儀（Bio-Rad 公司）；ChampGel 5000 型全自動凝膠成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；DYY-6C 型電泳儀、DYCP-31E 型電泳槽均購自北京市六一生物科技有限公司；DH6000型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；YT-CJ-1D 型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司）；ZHWY-100H 型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 葉片總RNA提取

參照TRNzol Universal總RNA 提取試劑說明書，使用TRNzol 試劑提取板藍根葉片總RNA，獲得的總RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 RT-PCR檢測

以1 μg總RNA為模板，random hexamers primer為引物，在M-MLV 反轉錄酶作用下合成RNA 鏈的互補cDNA 鏈。反應體系及操作步驟參照M-MLV 反轉錄酶使用說明書。獲得的cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于CMV、BBWV2 和Potyvirus檢測，檢測引物參照文獻合成[5-7]，擴增區(qū)域均為病毒的CP基因（表1）。取聚合酶鏈式反應（PCR）產物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳。使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒純化回收目標條帶并將目標條帶連接到pMD19-T 載體，每個片段選取3 個陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司測序。

表1 板藍根花葉病病毒檢測引物

2.3 CMV CP序列比對分析

序列比對分析采用DNAMAN 6.0軟件和美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn 程序。GenBank 數(shù)據(jù)庫下載13 個代表性CMV 株系/分離物，使用MEGA X軟件[8]中的ClustalW程序進行序列比對，使用鄰接法（neighbor joining，NJ）根據(jù)CMV CP 氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap 法（重復數(shù)為1000）評估系統(tǒng)發(fā)育進化樹?；ㄉ《荆╬eanut stunt virus，PSV）的ER 株系（PSV-ER）作為遠源關系參照。

3 結果

3.1 RT-PCR檢測結果

經RT-PCR，CMV 特異引物在BLG1～BLG5 中均擴增到1 條657 bp 的條帶（圖2）。BBWV2 特異引物和Potyvirus簡并引物在上述樣品中未擴增到條帶。將BLG3、BLG4 擴增條帶回收純化，連入pMD19-T 載體進行測序，獲得AH-BLG3 和AHBLG4 分離物序列（GenBank 登錄號：MW251398和MW251399），2 條片段均包含完整的CP基因，預計編碼218 aa。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，AH-BLG3 和AH-BLG4 分離物核苷酸和氨基酸序列相似度分別為99.39%和100%。BLASTn分析結果顯示，AH-BLG3和AH-BLG4 與我國白術上的CMV ZJAm 分離物（MK421103）相似度最高，核苷酸相似度分別為99.54%和98.93%，氨基酸相似度均為100%。上述結果明確了安徽省太和縣板藍根花葉病的病原為CMV。

圖2 RT-PCR檢測CMV

3.2 CMV安徽板藍根分離物系統(tǒng)進化分析

基于CMV CP 氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，上述所有CMV分離物分為Ⅰ組和Ⅱ組，其中Ⅰ組又可分為ⅠA 和ⅠB 亞組[9-10]。其中，AH-BLG3和AH-BLG4 分離物均屬于ⅠB 亞組，與白術ZJAm分離物和玉米Anhui 分離物聚為一支，親緣關系最近。AH-BLG3 和AH-BLG4 與北京地區(qū)板藍根上分離到的CMV-Ii 分離物分屬ⅠB 亞組的不同分支（圖3）。

圖3 基于CMV CP氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育進化樹

比較安徽省和北京地區(qū)板藍根CMVCP序列發(fā)現(xiàn)，AH-BLG3 和AH-BLG4 與CMV-Ii 分離物核苷酸序列相似度分別為98.17%和97.87%，氨基酸序列相似度均為99.08%，氨基酸在第91 位（T/L）和第168位（H/Y）存在差異（圖4）。

圖4 板藍根CMV分離物CP氨基酸序列比對

4 討論

植物病毒病是威脅藥用植物產量和品質的重要病害，病原種類繁多且復雜。1 種藥用植物可以受到多種病毒侵染，如太子參花葉病的病原有CMV、BBWV2、蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）[11]；1 種病毒也可危害多種藥用植物，如CMV 可侵染百合[12]、半夏[13]、三七[14]、白術[15]、柴胡[16]、丹參[17]、薄荷[18]等100 余科1200 余種植 物[2]。BBWV2 可侵染毛地黃[19]、柴胡[16]、白術[20]等藥用植物。馬鈴薯Y 病毒屬是植物病毒中最大的屬。該屬病毒可侵染多種藥用植物。例如，TuMV 可侵染太子參[11]、金蓮花[21]；馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）可侵染懷山藥[22]、菊花[23]；芋頭花葉病毒（dasheen mosaic virus，DsMV）可侵染半夏、天南星等[24]。

板藍根是清熱解毒類中藥的代表。近年來，常有板藍根花葉病的報道，本研究使用CMV、BBWV2的特異性檢測引物和Potyvirus的簡并引物，通過RT-PCR 方法對安徽省太和縣板藍根花葉病的病原進行鑒定，確定其病原為CMV，屬于ⅠB 亞組。逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測板藍根花葉病也存在一定的局限性。該方法僅能檢測特定病毒，板藍根葉片中是否還有其他病毒需通過高通量測序進一步確認。

藥用植物病毒病的檢測方法主要有生物學檢測、電子顯微鏡檢測、血清學檢測、分子生物學檢測等。徐潔[25]用普通煙草、洋酸漿等檢測侵染馬鈴薯的PVY；李明軍等[22]用電子顯微鏡檢測出侵染懷山藥的PVY；吳志明等[17]用DAS-ELISA 試劑盒檢測到侵染丹參的CMV；王寶霞等[3]用非依賴性PCR 和RT-PCR 檢測出侵染板藍根的BBWV2。各檢測方法有各自的優(yōu)缺點。在實際工作中，應根據(jù)不同的檢測條件及檢測目的，選擇合適的檢測方法。

植物病毒病的防治主要以預防為主，植株一旦發(fā)病，無有效的防治藥劑。防治方法主要有：1）對種子、種苗和無性繁殖材料進行檢驗和檢疫；2）通過莖尖組織培養(yǎng)進行脫毒；3）選育抗病品種；4）加強田間管理，培育壯苗；5）防治介體昆蟲，防止病毒傳播等[26]。自然界中CMV 主要通過蚜蟲等蟲媒以非持久方式傳播，也可通過機械傳播[4]965。因此，板藍根種植過程中應特別注意加強傳毒媒介的防治，及時清除帶毒植株，機械收割大青葉時注意農具消毒。板藍根多以種子繁殖，仍需實驗證明CMV 是否通過板藍根種子傳播。本研究結果證明，不同產區(qū)的板藍根植株攜帶的病毒具有地域特異性，生產上應加強不同板藍根產區(qū)病毒病發(fā)生及為害情況監(jiān)測。