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    雙標(biāo)線性校正法應(yīng)用于西洋參破壁飲片的指紋圖譜研究△

    2021-11-16 07:43:30于現(xiàn)花劉軍玲張亞中金傳山
    中國(guó)現(xiàn)代中藥 2021年9期
    關(guān)鍵詞:雙標(biāo)破壁西洋參

    于現(xiàn)花,劉軍玲,張亞中,金傳山

    1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院,安徽 合肥 230051

    西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根,原產(chǎn)地主要是美國(guó)與加拿大,我國(guó)從17 世紀(jì)開始引進(jìn)種植。其現(xiàn)已成為我國(guó)傳統(tǒng)滋補(bǔ)藥材。西洋參味甘、微苦,性涼,歸心、肺、腎經(jīng),具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津作用,用于氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內(nèi)熱消渴、口燥咽干[1]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),西洋參中含有多種有效成分,具有抗腫瘤、抗癌、降血壓、調(diào)血脂、抗疲勞等多種藥理活性[2-4]。

    西洋參破壁飲片是將傳統(tǒng)飲片細(xì)胞壁打破,通過現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)粉碎加工成D90(樣品累積分布百分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑)<45 μm 的粉體,再用無添加賦形技術(shù)制成30~100 目的顆粒新型中藥飲片。破壁飲片可使中藥的有效成分得到更充分釋放,進(jìn)而大幅提高藥效。與傳統(tǒng)飲片相比,西洋參破壁飲片具有全成分保留,成分利用率高,質(zhì)量均一,服用方式簡(jiǎn)單、快捷、靈活等特點(diǎn)[5-9]。近年來,破壁粉碎技術(shù)在中藥領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛,中藥破壁飲片品種逐漸增多,對(duì)破壁飲片的評(píng)價(jià)、產(chǎn)業(yè)化及應(yīng)用等方面的研究已成為中藥傳統(tǒng)飲片傳承與改良創(chuàng)新的熱門方向,并取得了一定成果。

    由于外觀性狀及顯微特征已被破壞,傳統(tǒng)飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已不適用于破壁飲片質(zhì)量控制要求[10]。另因西洋參特有成分?jǐn)M人參皂苷F11為弱紫外吸收成分,因此,需要建立高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器(HPLC-CAD),用于西洋參傳統(tǒng)飲片與破壁飲片的指紋圖譜分析。目前,指紋圖譜研究較為單一,一般僅在1 根色譜柱上開展分析,后續(xù)難以適用到其他色譜柱或用相對(duì)保留時(shí)間法進(jìn)行色譜峰的定性,其預(yù)測(cè)保留時(shí)間絕對(duì)偏差較大,實(shí)用性不佳。本實(shí)驗(yàn)采用雙標(biāo)線性校正法[11-14]預(yù)測(cè)特征峰的保留時(shí)間,據(jù)此建立的西洋參破壁飲片指紋圖譜可以適用于不同色譜柱,既擴(kuò)展了方法的適用范圍,又降低了對(duì)照品的使用成本,為西洋參破壁飲片質(zhì)量控制提供參考。

    1 材料

    Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司);XP26 型百萬分之一電子分析天平(Mettler公司);A11 型分析研磨機(jī)(IKA 公司);KQ-100 型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);Simplicity-185型超純水儀(Millipore公司)。

    16根色譜柱,編號(hào)col 1~col 16,規(guī)格均為250 mm×4.6 mm,5 μm。col 1:Agilent TC-C18(2);col 2:Diamonsil C18;col 3:GL Wondasil C18;col 4:Innoval C18;col 5:Inspire C18;col 6:JADE-PAK ODS-AQ;col 7:Kromasil 100 5-C18;col 8:Luna C18(2)100A;col 9:Shim-pack VP-ODS;col 10:Sonoma C18(2)100A;col 11:Tech Mate C18ST;col 12:Waters Symmetry C18;col 13:ZORBAX Eclipse XDB C18;col 14:ZORBAX SB C18;col 15:Waters XBridge C18;col 16:Kinetex C18100A。

    對(duì)照品擬人參皂苷F11(批號(hào):110841-200505,純度≥98%)、人參皂苷Rg1(批號(hào):110703-201128,純度≥93.4%)、人參皂苷Re(批號(hào):110754-201626,純度≥92.7%)、人參皂苷Rb1(批號(hào):110704-201122,純度≥92.9%)、人參皂苷Rc(批號(hào):110021-14-0,純度≥98%)、人參皂苷Rb2(批號(hào):111715-200501,純度≥98%)、人參皂苷Rb3(批號(hào):111686-200501,純度≥98%)、人參皂苷Rd(批號(hào):111818-201001,純度≥94.4%)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;DRS Origin 軟件由中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院設(shè)計(jì)研發(fā),科邁恩(北京)科技有限公司開發(fā);乙腈和甲醇為色譜純;正丁醇為分析純;水為超純水。

    10 批西洋參(編號(hào)XYS-01~XYS-10)均購于安徽宏信藥業(yè)發(fā)展有限公司,經(jīng)安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院張亞中主任中藥師鑒定為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B),線性梯度洗脫(0~5 min,81% B;5~25 min,81%~78%B;25~30 min,78%~74%B;30~55 min,74%~50%B;55~60 min,50%~81%B);柱溫:30 ℃;流速:1 mL·min-1;CAD 霧化器溫度:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。上述條件下,各成分分離較好。

    2.2 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱取各人參皂苷對(duì)照品適量,置于5 mL 量瓶中,加甲醇溶解定容,配制成含人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及擬人參皂苷F11分別為0.042 8、0.130 1、0.035 3、0.056 4、0.025 0、0.029 7、0.061 2、0.097 7 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

    2.3 供試品溶液的制備

    精密稱取供試品1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,超聲(250 W,50 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.4 方法學(xué)考察

    2.4.1 精密度試驗(yàn) 取2.2 項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次,每次進(jìn)樣10μL。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及擬人參皂苷F11峰面積的RSD 分別為1.70%、0.30%、0.78%、0.84%、0.49%、0.91%、0.68%、1.55%,表明儀器精密度良好。

    2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品(XYS-02)粉末,分別按2.3 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,測(cè)定并計(jì)算其含量。樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及擬人參皂苷F11各含量的RSD分別為0.98%、1.12%、1.08%、1.35%、0.79%、1.02%、1.31%、0.45%,表明本法重復(fù)性良好。

    2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制備的供試品溶液(XYS-02),室溫下放置,分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定,人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd及擬人參皂苷F11峰面積的RSD分別為1.27%、0.96%、1.68%、1.44%、1.64%、0.85%、1.26%、0.43%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.5 西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片相似度評(píng)價(jià)分析

    采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012 版軟件,中位數(shù)法(時(shí)間窗為0.1)分別建立西洋參破壁飲片及傳統(tǒng)飲片指紋圖譜共有模式。結(jié)果顯示,西洋參破壁飲片及傳統(tǒng)飲片指紋圖譜均標(biāo)定17 個(gè)共有峰,并指認(rèn)出1 號(hào)峰為人參皂苷Rg1、2 號(hào)峰為人參皂苷Re、3 號(hào)峰為擬人參皂苷F11、4 號(hào)峰為人參皂苷Rb1、5 號(hào)峰為人參皂苷Rc、6 號(hào)峰為人參皂苷Rb2、7 號(hào)峰為人參皂苷Rb3、8號(hào)峰為人參皂苷Rd,結(jié)果見圖1。計(jì)算10 批破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的相似度。結(jié)果顯示,各批破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的相似度均大于0.939(表1)??梢?,不同批次間破壁飲片產(chǎn)品均一性和穩(wěn)定性較好。由圖2 可知,各批次破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的關(guān)聯(lián)性較好,也說明西洋參傳統(tǒng)飲片制成破壁飲片后,各主要成分均較定,體現(xiàn)了破壁飲片與原傳統(tǒng)飲片的物質(zhì)基礎(chǔ)一致,保留飲片全成分的特性。

    圖1 對(duì)照品、西洋參傳統(tǒng)飲片供試品和破壁飲片供試品色譜圖

    圖2 西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜

    表1 10批西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的相似度

    2.6 雙標(biāo)線性校正法定性研究

    2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間(SRT)的計(jì)算 液相色譜中,化學(xué)成分在不同色譜儀和不同色譜柱上的保留時(shí)間具有線性關(guān)系[15]。通過對(duì)照品的保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰定位,得到樣品實(shí)際保留時(shí)間,以15 根色譜柱得到的對(duì)照品保留時(shí)間平均值作為SRT[16]。分別以8 個(gè)成分的SRT 為橫坐標(biāo),依次為人參皂苷Rg132.271 min、人參皂苷Re 32.791 min、擬人參皂苷F1142.371 min、人參皂苷Rb143.933 min、人參皂苷Rc 44.881 min、人參皂苷Rb245.833 min、人參皂苷Rb346.142 min、人參皂苷Rd 47.977 min。以實(shí)際保留時(shí)間為縱坐標(biāo),得到各色譜柱的保留時(shí)間擬合結(jié)果,見圖3,各色譜柱的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

    圖3 不同色譜柱保留時(shí)間關(guān)系

    由圖3 和表2 可見,col 15 色譜柱的保留時(shí)間擬合直線相對(duì)有偏離,說明成分在col 15色譜柱相較于其他色譜柱保留時(shí)間相差較大。余下col 1~col 14 色譜柱相關(guān)系數(shù)均在0.999 以上,說明這14 根色譜柱的保留時(shí)間的線性關(guān)系良好,可用于西洋參破壁飲片的定性評(píng)價(jià)分析。

    表2 不同色譜柱上保留時(shí)間的線性方程及相關(guān)系數(shù)

    2.6.2 雙標(biāo)化合物的確定 通過DRS Origin 軟件的計(jì)算,篩選出了10種雙標(biāo)選擇方案(表3),10種方案色譜柱符合率均達(dá)到95%,其中峰2~6 組合的預(yù)測(cè)正確率及色譜柱符合率均為100%,且保留時(shí)間回歸偏差最小。在未知色譜柱(以col 16 為驗(yàn)證柱)上運(yùn)行雙標(biāo)對(duì)照品溶液和供試品溶液,將人參皂苷Re 和人參皂苷Rb2作為西洋參破壁飲片液相色譜的雙標(biāo)化合物,以這2 個(gè)成分的SRT 為橫坐標(biāo),實(shí)際保留時(shí)間人參皂苷Re 32.791 min、人參皂苷Rb245.833 min 為縱坐標(biāo),得到2 點(diǎn)人參皂苷Re(32.791、31.628)和人參皂苷Rb2(45.833、44.491),做一直線,得到方程Y=0.986 3X-0.712 9,然后將其余6 個(gè)成分的SRT 值代入方程,得到SRT:人參皂苷Rg131.116 min、擬人參皂苷F1141.078 min、人參皂苷Rb142.618 min、人參皂苷Rc 43.553 min、人參皂苷Rb344.797 min、人參皂苷Rd 46.607 min。實(shí)際保留時(shí)間依次為31.628、41.036、42.828、43.663、44.757、46.451 min。單純定性條件下,滿足預(yù)測(cè)保留時(shí)間與實(shí)測(cè)保留時(shí)間的誤差應(yīng)不超過0.5 min 的要求[16],說明該雙標(biāo)選擇在col 16 上保留時(shí)間預(yù)測(cè)效果良好。

    表3 10種雙標(biāo)化合物選擇方案

    2.6.3 雙標(biāo)線性校正法與相對(duì)保留時(shí)間法的對(duì)比對(duì)雙標(biāo)線性校正法與相對(duì)保留時(shí)間法在西洋參破壁飲片液相色譜中定性的優(yōu)劣進(jìn)行比較。雙標(biāo)線性校正法以色譜圖靠近兩端的人參皂苷Re和人參皂苷Rb2為雙標(biāo)化合物,相對(duì)保留時(shí)間法以人參皂苷Rb2為參照物,表4 為在15 根色譜柱上2 種方法的比較結(jié)果,與相對(duì)保留時(shí)間法比較,雙標(biāo)線性校正法的保留時(shí)間預(yù)測(cè)值的絕對(duì)偏差波動(dòng)范圍較小且絕對(duì)偏差較低。由此可見,雙標(biāo)線性校正預(yù)測(cè)保留時(shí)間的準(zhǔn)確性優(yōu)于相對(duì)保留時(shí)間。

    表4 不同色譜柱2種方法不同成分保留時(shí)間預(yù)測(cè)值的絕對(duì)偏差

    3 討論

    3.1 檢測(cè)器的選擇

    擬人參皂苷F11作為西洋參特征成分,母體結(jié)構(gòu)為奧克娣隆型化合物,在紫外區(qū)僅有末端吸收。通過比較西洋參破壁飲片的CAD 與二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)圖譜,發(fā)現(xiàn)DAD 下未見相應(yīng)峰,而CAD 下響應(yīng)較好,指紋特征性更強(qiáng)且靈敏度高,基線更平穩(wěn)。故選擇CAD 建立西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜研究。

    3.2 前處理及色譜條件的選擇

    本實(shí)驗(yàn)選用HPLC 測(cè)定皂苷類成分,對(duì)水飽和正丁醇與甲醇不同溶劑、超聲與加熱回流不同提取方法及提取時(shí)間等進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn),甲醇超聲30 min提取的供試品溶液色譜峰信息全面完整且操作簡(jiǎn)單,足以適用于對(duì)西洋參破壁飲片定性研究。所用流動(dòng)相有乙腈-0.01%三氟乙酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水等[17-18]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn),以乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫系統(tǒng)顯示的圖譜峰形好、基線平穩(wěn),可滿足8 個(gè)皂苷類成分的分離要求,且水相較于三氟乙酸和甲酸更安全、經(jīng)濟(jì)又方便。

    本研究采用HPLC-CAD 建立西洋參破壁飲片的指紋圖譜,同時(shí),對(duì)同批次來源的西洋參傳統(tǒng)飲片指紋圖譜的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)分析,探究?jī)烧咧g的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示,傳統(tǒng)飲片與破壁飲片之間色譜峰相似度均大于0.939,各共有峰的保留時(shí)間幾乎一致。這表明,西洋參傳統(tǒng)飲片經(jīng)破壁粉碎并制成破壁飲片的過程中,化學(xué)成分無明顯變化,超微破壁粉碎技術(shù)并未造成傳統(tǒng)飲片中主成分流失及新化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化或生成[19]。筆者又結(jié)合DRS Origin 軟件對(duì)15 根色譜柱采集的西洋參破壁飲片數(shù)據(jù)擬合,進(jìn)而對(duì)色譜峰定位,確定雙標(biāo)化合物,再用雙標(biāo)線性校正預(yù)測(cè)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間。結(jié)果與相對(duì)保留時(shí)間法相比,雙標(biāo)線性校正法預(yù)測(cè)定位更準(zhǔn)確且實(shí)用方便,表明該方法在中藥復(fù)雜的多指標(biāo)成分定性方面有著很好的應(yīng)用前景。

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