基于土壤碳循環(huán)的丹參連作障礙機(jī)制研究△

崔寧，陳為序，李琦，李西文

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；4.上藥華宇（臨沂）中藥資源有限公司，山東 臨沂 276000；5.上海市藥材有限公司，上海 200002

連作障礙指連茬種植同一種或同一科植物，即使在正常的管理?xiàng)l件下，也會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、病蟲害加重的現(xiàn)象[1]。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰功效，用于治療胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛等疾病[2]，已有近2000 年的臨床應(yīng)用歷史。近年來(lái)，隨著心腦血管疾病發(fā)病率上升，丹參市場(chǎng)需求不斷增加[3]，但野生丹參供給量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。目前，丹參藥材多以栽培為主。在丹參人工種植過程中，連作障礙現(xiàn)象十分嚴(yán)重[4]。連作丹參長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱，根內(nèi)部木質(zhì)化、生長(zhǎng)畸形，常伴有裂根等現(xiàn)象[5]。連作2 年丹參地下部鮮質(zhì)量下降56.5%，干質(zhì)量下降54.2%；根脂溶性成分二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量分別下降35.3%、32.3%、19.4%、3.4%；水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B分別下降66.9%和64.4%[6]。連作對(duì)高品質(zhì)丹參藥材的生產(chǎn)造成極大影響。因此，揭示連作障礙機(jī)制，進(jìn)而解決丹參連作障礙問題刻不容緩。

丹參連作障礙機(jī)制研究主要包括土壤理化性質(zhì)改變[7]、化感自毒作用[8]及土壤微生物種群失衡[9]3 個(gè)方面，均從丹參生長(zhǎng)環(huán)境變化的角度闡釋連作障礙機(jī)制，未包括丹參自身生理生長(zhǎng)的影響，未從根本上揭示連作引起局部生態(tài)系統(tǒng)從正常動(dòng)態(tài)偏離的復(fù)雜自適應(yīng)現(xiàn)象。因此，迫切需要從新的角度剖析連作障礙現(xiàn)象，為丹參大規(guī)模連續(xù)種植提供技術(shù)支撐。

目前，連作障礙研究主要關(guān)注點(diǎn)在植物根系細(xì)胞的數(shù)量及土壤微生物的豐度，忽視了兩者的新陳代謝活力。然而，根系細(xì)胞及土壤微生物活性的高低能夠指示植物自身、植物與土壤之間及土壤內(nèi)部物質(zhì)代謝的旺盛程度，可以作為衡量土壤質(zhì)量狀況、維持土壤肥力和藥材品質(zhì)形成的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)維持藥用植物根際微生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要作用。因此，可嘗試從連作對(duì)植物及土壤物質(zhì)代謝抑制作用角度揭示連作障礙發(fā)生機(jī)制。

土壤呼吸指土壤釋放二氧化碳的過程，主要由微生物氧化有機(jī)物（異養(yǎng)呼吸）和根系呼吸（自養(yǎng)呼吸）產(chǎn)生。連作障礙本質(zhì)是單一種群的連續(xù)種植對(duì)土壤的理化性質(zhì)和微生物群落產(chǎn)生了影響，可以通過測(cè)定土壤呼吸間接反映根系細(xì)胞/土壤微生物活力水平，進(jìn)而推測(cè)丹參與連作土壤之間的相互負(fù)反饋情況。開路式土壤碳通量測(cè)量系統(tǒng)可以測(cè)定碳通量及土壤呼吸速率，在土壤碳循環(huán)研究中廣泛應(yīng)用[10-11]。本研究通過測(cè)定不同連作年限丹參根際微生態(tài)系統(tǒng)土壤碳通量，探索連作對(duì)土壤呼吸的影響，從土壤呼吸角度闡釋連作障礙現(xiàn)象，為后續(xù)連作障礙問題解決提供新思路。

1 材料

樣品經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李西文副研究員鑒定為1～5 年生唇形科鼠尾草屬丹參Salvia miltiorrhizaBge.植株。碳通量檢測(cè)采用LI-8100 型土壤碳通量自動(dòng)測(cè)量系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究試驗(yàn)地點(diǎn)位于山東省臨沂市平邑縣上藥華宇（臨沂）中藥資源有限公司丹參基地。該地區(qū)平均年降水量707～759 mm，年平均氣溫13.5～14.0 ℃，年均相對(duì)濕度58.3%～59.8%，年平均日照153.7～254.4 W·m-2，土壤類型為低活性淋溶土，適宜丹參生長(zhǎng)。

2019 年3 月，分別于空白地塊（前茬未種丹參）及連續(xù)種植丹參1～3 年樣地（各樣地丹參生長(zhǎng)周期均為1 年）起壟，樣地種植丹參，種植參數(shù)相同。后經(jīng)相同田間管理，于2019年11月測(cè)定空白及丹參連作地塊的土壤樣品。選擇連續(xù)氣溫及空氣濕度相對(duì)穩(wěn)定的5 d，采用土壤碳通量自動(dòng)測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定空白及丹參不同連作年限地塊的土壤總呼吸。每個(gè)地塊于測(cè)定前1 d 隨機(jī)選擇36 個(gè)丹參植株，去除丹參地上部分及雜草，布置內(nèi)徑20 cm 的土壤環(huán)，每個(gè)土壤環(huán)上緣露出地表2～3 cm。從7:00—17:00，每2 h 測(cè)定6 個(gè)土壤環(huán)，每個(gè)土壤環(huán)連續(xù)測(cè)定3 次?？瞻椎貕K于壟上直接隨機(jī)選點(diǎn)測(cè)定。系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)為：Obs.Length 1:30，Dead Band 20 s，Obs.Count 3，Pre-Purge 15 s，Post-Purge 15 s。系統(tǒng)配置的溫度探針和水分傳感器即時(shí)測(cè)量地表下10 cm 處土壤溫度及濕度。

2.2 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各地塊碳通量及溫濕度數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、比較并作箱式圖；Microsoft Excel 2016 做柱狀圖及折線圖；R v.3.6.3軟件stats 包中prcomp 函數(shù)對(duì)各測(cè)量點(diǎn)的碳通量和土壤溫濕度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），并用ggplot2 包中g(shù)gplot 函數(shù)進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果

3.1 土壤碳通量及土壤呼吸速率日變化特征

由圖1 可知，丹參不同連作年限地塊土壤呼吸速率日變化曲線均呈單峰，且變化趨勢(shì)一致，從7:00 開始，土壤呼吸速率隨著時(shí)間的推移逐漸增加，最高值均出現(xiàn)在13:00，隨后逐漸下降。除連作4 年地塊（圖1E）外，各地塊碳通量最低值均出現(xiàn)在7:00。

圖1 丹參根部土壤呼吸速率日變化曲線

3.2 丹參不同連作年限地塊土壤呼吸速率

如圖2所示，丹參種植1年和連作2年地塊土壤碳通量較高，均值分別為0.696 3、0.728 5 μmol·m-2·s-1，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；連作3 年地塊碳通量稍低，均值為0.603 2 μmol·m-2·s-1，與連作2 年地塊間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；連作4 年丹參地塊碳通量最小，均值為0.504 1 μmol·m-2·s-1，與連作3 年地塊間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白地塊土壤呼吸速率比各連作地塊低，碳通量均值為0.329 1 μmol·m-2·s-1，與其他地塊差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖2 丹參根部土壤碳通量比較

3.3 丹參不同連作年限地塊土壤溫濕度比較

3.3.1 土壤溫度的比較 丹參不同連作年限地塊土壤溫度日變化曲線趨勢(shì)基本一致（圖3）。除連作2 年地塊外，7:00—17:00 土壤溫度先降低后升高，最低值出現(xiàn)在9:00。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)測(cè)定的5 d 內(nèi)，不同連作年限地塊土壤溫度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.484）。

圖3 丹參根部土壤溫度日變化曲線

3.3.2 土壤濕度的比較 由圖4 可知，不同連作年限地塊土壤濕度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.785，P<0.01）。土壤濕度大小順序?yàn)檫B作1 年地塊（0.083 96 m3·m-3）>2年地塊（0.08140m3·m-3）>4年地塊（0.056 00 m3·m-3）>3年地塊（0.041 22 m3·m-3）>空白地塊（0.033 00 m3·m-3）。其中，連作1 年地塊與連作2 年地塊之間土壤濕度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，連作3年、4年與空白地塊之間土壤濕度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，連作2 年地塊與4 年地塊差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖4 丹參根部土壤濕度（,n=36）

3.4 PCA

如圖5 所示PC1（貢獻(xiàn)率40.20%）主要由土壤濕度（pca_loadings 值0.707 4）及碳通量（pca_loadings 值0.672 0）組成。PC2（貢獻(xiàn)率33.34%）主要由土壤溫度（pca_loadings值-0.950 1）組成。根據(jù)樣點(diǎn)重合率可將5 個(gè)地塊分為3 組：連作1 年、2 年地塊組，連作3 年、4 年地塊組和空白地塊組。數(shù)據(jù)顯示，連作1年與2年地塊之間、連作3年與4年地塊之間土壤相似度較高。由于主要依靠PCA1將樣點(diǎn)粗略分為3 組，說明連作地塊的主要差異因素為碳通量和土壤濕度。

圖5 丹參不同連作年限地塊PCA結(jié)果

4 討論

4.1 連作對(duì)土壤呼吸速率及土壤溫度、濕度的影響

4.1.1 連作對(duì)土壤呼吸速率的影響 土壤呼吸是指土壤釋放二氧化碳的過程，主要由生物氧化有機(jī)物和根系呼吸產(chǎn)生，另有極少部分是土壤動(dòng)物和化學(xué)氧化釋放。土壤呼吸是一種復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到多種因素的影響，如土壤溫度[12]、土壤含水量[12]、降水[13]、凋落物、土地利用方式[14]及土壤碳、氮含量等非生物因子等。其中，土地利用方式對(duì)土壤呼吸的影響主要是通過改變植被覆蓋和土壤性質(zhì)實(shí)現(xiàn)[15]。植被覆蓋的改變可以影響土壤表層的能量平衡和近地層的空氣相對(duì)濕度。在植物根系作用下，土壤性質(zhì)的改變一方面可以反作用于植物根系，另一方面對(duì)土壤微生物也會(huì)產(chǎn)生極大的影響。同種或同科植物連茬種植后，即使在正常的栽培管理?xiàng)l件下，也多會(huì)造成植株矮小、長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酢⑼寥乐脖桓采w度變?。贿B作還易造成土壤理化性質(zhì)惡化、pH 降低、有機(jī)質(zhì)含量降低、土壤次生鹽漬化等，從而對(duì)植物根系及土壤微生物產(chǎn)生抑制作用[16]。因此，土地利用方式與連作因素對(duì)土壤呼吸的作用方式相似?；诖耍n題組考察了連作對(duì)土壤呼吸的影響，將土壤呼吸相關(guān)測(cè)定技術(shù)應(yīng)用到藥用植物研究領(lǐng)域，為揭示連作障礙發(fā)生機(jī)制提供了新思路。

丹參根部土壤呼吸速率在丹參種植前2 年差異不大，但隨種植年限增加而顯著降低。從土壤生態(tài)環(huán)境角度來(lái)看，目前丹參主產(chǎn)區(qū)種植2 年后采收是適當(dāng)?shù)?。此外，連作土壤呼吸速率下降、根系細(xì)胞及根際微生物物質(zhì)代謝活性降低與連作導(dǎo)致丹參藥材多項(xiàng)指標(biāo)下降一致，如連作丹參根變細(xì)、根長(zhǎng)減小、根質(zhì)量下降、產(chǎn)量降低、商品率下降等。丹參1 個(gè)種植周期后，需要開展輪作或進(jìn)行土壤改良?？瞻椎貕K的碳通量數(shù)值最低，可能是由于空白地塊未種植丹參，土壤微生物缺乏根系分泌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在微生物豐度、多樣性及代謝活性等方面與丹參種植地塊產(chǎn)生差異所致。

4.1.2 連作對(duì)土壤溫度、濕度的影響 本研究中，不同連作年限地塊的土壤溫度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)，丹參連作對(duì)土壤溫度未造成影響。且在測(cè)量時(shí)間內(nèi)與其他地塊相比，空白地塊的溫度變化幅度最大，9:00 后升溫速率最快，推測(cè)其原因是空白地塊缺少丹參植株覆蓋。各地塊土壤濕度存在差異，大小順序?yàn)檫B作1年和連作2年地塊>連作4 年和連作3 年地塊>空白地塊。隨著連作年限增加，土壤濕度逐漸減小。這種規(guī)律可能是由連作對(duì)丹參植株的間接抑制作用產(chǎn)生。丹參在整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期不斷向環(huán)境中釋放代謝產(chǎn)物。連續(xù)種植，代謝產(chǎn)物積累，達(dá)到限度后迫使土壤微生物組群落結(jié)構(gòu)功能調(diào)整，異養(yǎng)呼吸發(fā)生變化。在此環(huán)境下，丹參植株的各項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)被抑制，根系自養(yǎng)呼吸減弱、持水能力減弱，最終造成土壤濕度降低。同時(shí)，土壤含水量降低、易缺水干旱，又會(huì)反過來(lái)脅迫連作丹參，抑制其生長(zhǎng)。

4.2 “土壤碳循環(huán)減弱”導(dǎo)致丹參連作障礙的科學(xué)假設(shè)

目前，植物連作障礙機(jī)制研究主要包括3 個(gè)方面：土壤理化性質(zhì)惡化[17]、化感自毒作用[18]及土壤微生物種群失衡[19]。基本內(nèi)涵分別包括：1）土壤理化性質(zhì)惡化機(jī)制。連作會(huì)造成土壤酸化，土壤養(yǎng)分有效性改變，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)與發(fā)育。2）化感自毒作用機(jī)制。大多數(shù)植物具有自毒作用，植物可以通過多種途徑釋放自毒物質(zhì)對(duì)同茬或下茬同種或同科植物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。一種植物化感自毒物質(zhì)通常含有多種成分，以混合物形式作用于周圍環(huán)境及植物體[20]。3）土壤微生物種群失衡機(jī)制。連作使土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)變化、菌群多樣性改變、有益菌減少、有害菌增多、土壤生態(tài)功能紊亂，進(jìn)而造成連作障礙。然而，以上3 種機(jī)制均無(wú)法全面揭示植物連作障礙現(xiàn)象本質(zhì)。其中，土壤理化性質(zhì)惡化機(jī)制究其根本應(yīng)為植物和（或）微生物對(duì)環(huán)境的響應(yīng)，并非主動(dòng)改變。植物化感自毒作用機(jī)制因受目前科技水平限制，無(wú)法系統(tǒng)考察一種植物的所有自毒物質(zhì)[21]，也就無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的機(jī)制內(nèi)涵詮釋和有效驗(yàn)證。根際微生物失衡機(jī)制研究受數(shù)據(jù)庫(kù)和人工培養(yǎng)技術(shù)限制，無(wú)法準(zhǔn)確定義連作相關(guān)核心微生物種群，也無(wú)法進(jìn)行有效的結(jié)果驗(yàn)證[22]。

目前，丹參的連作障礙發(fā)生機(jī)制不明確，且與整個(gè)植物學(xué)相比，其機(jī)制基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后。研究表明，丹參連作使土壤pH 降低[23]，頭茬到四茬土壤pH 由8.02 降至7.32[24]，土壤中多種酶活性降低[25]，其他土壤理化指標(biāo)變化研究較少，且關(guān)于丹參化感自毒物質(zhì)的研究尚無(wú)報(bào)道。丹參須根腐解可造成多種物質(zhì)累積水平增加[26]，但對(duì)增加的腐解產(chǎn)物需進(jìn)行效應(yīng)驗(yàn)證。經(jīng)過短期連作土壤擴(kuò)增子測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，丹參連作使根際土壤細(xì)菌數(shù)量減少[27]，真菌數(shù)量增加[28]，功能微生物群落數(shù)目改變，多樣性指數(shù)減小，但未有長(zhǎng)期的跟蹤研究報(bào)道。

本研究表明，丹參連作使根際微生態(tài)系統(tǒng)土壤呼吸減弱，說明連作在減少根系細(xì)胞數(shù)量（體現(xiàn)在連作丹參根部萎縮、變細(xì)、變短及根質(zhì)量減少等）、改變根際微生物相對(duì)豐度及多樣性的同時(shí)，對(duì)土壤碳循環(huán)過程也具有抑制作用。土壤呼吸速率變化是丹參根和根際微生物的整體表現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，本課題組提出丹參連作障礙機(jī)制“土壤碳循環(huán)減弱”的科學(xué)假設(shè)，即連作丹參代謝產(chǎn)物大量積累造成根際微生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)減慢，進(jìn)而抑制丹參根系生長(zhǎng)發(fā)育，改變根際微生物組結(jié)構(gòu)，造成土壤微環(huán)境變化。該假設(shè)與原有3 種機(jī)制相比，把丹參根部生理現(xiàn)象與環(huán)境變化很好地結(jié)合起來(lái)，而不是把生態(tài)環(huán)境因素單獨(dú)處理，相關(guān)驗(yàn)證研究正在進(jìn)行中。本研究從土壤微生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的角度揭示丹參連作障礙現(xiàn)象，為進(jìn)一步解決連作障礙問題提供思路。