基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的補(bǔ)腎和脈方治療高血壓作用機(jī)制研究△

張李慧，蘇文革

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011

我國(guó)高血壓人口調(diào)查結(jié)果顯示，近30 年，高血壓患病率不斷上升，目前約有30%的成年人患有高血壓[1-4]。由于高患病率和伴隨的血管風(fēng)險(xiǎn)，高血壓是中國(guó)腦血管疾病（CVD）死亡的最重要原因之一[4]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，高血壓治療率和控制率分別低于50%和20%[5-11]，因此，對(duì)其的防控成為一項(xiàng)國(guó)家公共衛(wèi)生重點(diǎn)工作[12]。

根據(jù)患者頭暈、頭痛、眩暈等主要臨床證候，高血壓屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”范疇[13]；如果以心慌、胸悶、胸痛為主要臨床表現(xiàn)，則屬于“心悸”“胸痹”范疇；如果患者出現(xiàn)突然昏仆、神志模糊不清、抽搐、半身不遂、口舌歪斜等癥狀，就屬于“中風(fēng)”范疇。中醫(yī)上本病以肝腎陰陽(yáng)失調(diào)為本，風(fēng)、火、痰、瘀為標(biāo)。治療原則以調(diào)整陰陽(yáng)、補(bǔ)虛瀉實(shí)為主。虛證者以肝腎陰虛為主，采用滋補(bǔ)肝腎；實(shí)證者根據(jù)具體情況分別施以潛陽(yáng)、瀉火、化痰、逐瘀等法[13]。

補(bǔ)腎和脈方（生黃芪、黃精、桑寄生、淫羊藿、炒杜仲、女貞子、懷牛膝、澤瀉、川芎、當(dāng)歸、地龍）是在傳承山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院周次清教授“從肝腎分期論治高血壓”專(zhuān)病學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，通過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐和系列化的臨床研究，依據(jù)補(bǔ)腎經(jīng)方腎氣丸、調(diào)肝經(jīng)方當(dāng)歸芍藥散合方而開(kāi)發(fā)的現(xiàn)代制劑，多項(xiàng)臨床研究表明，其可以有效降低收縮壓和縮小脈壓，延緩動(dòng)脈硬化進(jìn)程，形成了局部降壓優(yōu)勢(shì)，具有更全面的心血管保護(hù)效應(yīng)[14-18]。但中藥具有多組分特性，其作用于機(jī)體的機(jī)制也相對(duì)復(fù)雜，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法研究中藥分子機(jī)制相對(duì)困難，而且會(huì)耗費(fèi)大量人力物力。系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展為明確中醫(yī)藥發(fā)揮療效的分子機(jī)制提供了新的研究思路[19-21]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析補(bǔ)腎和脈方的有效活性成分和作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步預(yù)測(cè)補(bǔ)腎和脈方治療高血壓的靶點(diǎn)，并對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，探討補(bǔ)腎和脈方治療高血壓的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物活性化合物及其作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）預(yù)測(cè)補(bǔ)腎和脈方活性成分及作用靶點(diǎn)。將補(bǔ)腎和脈方中藥物（生黃芪、黃精、桑寄生、淫羊藿、炒杜仲、女貞子、懷牛膝、澤瀉、川芎、當(dāng)歸、地龍）輸入TCMSP中，查詢(xún)獲得各味藥活性成分，并基于吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數(shù)，按生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18進(jìn)行篩選，獲得藥物活性成分。由于地龍未在TCMSP中獲得有效成分，故未納入此次分析研究中。再通過(guò)TCMSP查找藥物活性成分的作用靶點(diǎn)，并于UniProt網(wǎng)站搜索得到每個(gè)成分靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)基因。

1.2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述各藥物的化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)上傳至Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行補(bǔ)腎和脈方藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

1.3 疾病靶點(diǎn)檢索

通過(guò)檢索TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca/）、GAD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://geneticassociationdb.nih.gov/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org/search）及PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org/），以“hypertension”為關(guān)鍵詞進(jìn)行高血壓的疾病靶點(diǎn)檢索。對(duì)從這6 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的檢索結(jié)果進(jìn)行匯總、對(duì)比分析并取交集，最終獲得高血壓疾病相關(guān)靶標(biāo)基因。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

對(duì)1.1項(xiàng)下獲得的補(bǔ)腎和脈方相關(guān)靶點(diǎn)和1.3項(xiàng)下獲得的高血壓相關(guān)靶點(diǎn)取交集，作為補(bǔ)腎和脈方治療高血壓病的靶點(diǎn)。然后上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string.embl.de/）進(jìn)行處理，建立PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

運(yùn)用Cytoscape 3.6.1 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出核心靶點(diǎn)，即關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（Hub 節(jié)點(diǎn)）。對(duì)于PPI 網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)，選擇度（degree）[22]、介數(shù)中心性（betweenness centrality）[23]、接近中心性（closeness centrality）[24]3 個(gè)參數(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。Hub節(jié)點(diǎn)的閾值是各參數(shù)對(duì)應(yīng)的中值。

1.6 富集分析

通過(guò)基因富集分析在線工具DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎和脈方活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP 檢索獲得補(bǔ)腎和脈方活性成分923 個(gè)，根據(jù)OB 和DL 條件進(jìn)行篩選，得到有效活性成分110 個(gè)，部分活性成分信息見(jiàn)表1。對(duì)110 個(gè)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，最終得到166 個(gè)藥物潛在靶點(diǎn)，部分靶點(diǎn)信息見(jiàn)表2。

表1 補(bǔ)腎和脈方部分活性成分信息

表2 補(bǔ)腎和脈方部分靶點(diǎn)信息

2.2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.6.1 對(duì)補(bǔ)腎和脈方活性成分及預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。

圖1 補(bǔ)腎和脈方藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 高血壓相關(guān)靶點(diǎn)

由TTD、OMIM、DrugBank、GAD、PharmGKB、DisGeNET 檢索得到高血壓病相關(guān)靶點(diǎn)分別為66、200、166、747、129、277 個(gè)，去重后為1169 個(gè)，包括花生四烯酸鹽5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5）、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、表皮生長(zhǎng)因子（pro-epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等靶點(diǎn)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取得交集得到關(guān)鍵靶點(diǎn)83 個(gè)，上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行處理，由于靶點(diǎn)基因PDE3A 與其他靶點(diǎn)未建立起聯(lián)系，故刪除，其他82個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)建立PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.5 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

將PPI網(wǎng)絡(luò)上傳至Cytoscape 3.6.1，共82個(gè)點(diǎn)，693 邊，進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?。以度、介?shù)中心性和接近中心性3 個(gè)主要參數(shù)為基礎(chǔ)，選取中值以上的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建補(bǔ)腎和脈方治療高血壓作用的Hub 節(jié)點(diǎn)。經(jīng)過(guò)2 次篩選后，得到11 個(gè)節(jié)點(diǎn)和43條邊，PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浜Y選過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)腎和脈方治療高血壓PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

11個(gè)節(jié)點(diǎn)及其度值分別為IL-6（40）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶3（NOS3，39）、腫瘤壞死因子（TNF，35）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF，35）、VEGFA（34）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2，34）、過(guò)氧化氫酶（CAT，33）、乙酰膽堿酯酶（ACHE，31）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN，30）、鈉依賴(lài)性血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體（SLC6A4，29）和凝血酶（F2，26），并體現(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)圖中，這11個(gè)節(jié)點(diǎn)是該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖3）。

圖3 補(bǔ)腎和脈方治療高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，將2.4 項(xiàng)下83 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因上傳并進(jìn)行富集分析。GO分析包括分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）和細(xì)胞成分（CC），共得到315個(gè)GO條目（P≤0.05），其中與BP相關(guān)的條目最多，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.05 篩選，確定28個(gè)條目與BP相關(guān)，前20個(gè)BP條目主要涉及腺苷酸環(huán)化酶激活的腎上腺素能受體信號(hào)通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、藥物反應(yīng)（response to drug）、缺氧反應(yīng)（response to hypoxia）、磷脂酶C 激活的G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路（phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway）、血管收縮的正調(diào)節(jié)（positive regulation of vasoconstriction）等生物分析過(guò)程，見(jiàn)表3。

表3 補(bǔ)腎和脈方治療高血壓靶點(diǎn)的GO生物過(guò)程分析

KEGG共得到53條信號(hào)通路，符合P≤0.05的有45 條，列舉前20 條通路，見(jiàn)表4。其中同時(shí)符合FDR≤0.05的通路主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、5-羥色胺能突觸通路（serotonergic synapse）、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-蛋白激酶信號(hào)通路（cGMP-PKG signaling pathway）、環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路（drug metabolism-cytochrome P450）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、化學(xué)致癌通路（chemical carcinogenesis）8條。

表4 補(bǔ)腎和脈方治療高血壓靶點(diǎn)的KEGG富集分析

3 討論

補(bǔ)腎和脈方是楊傳華教授基于老年高血壓病“腎氣虧虛為本、血脈自病為標(biāo)”的病機(jī)觀和“補(bǔ)腎氣、和血脈”治法觀創(chuàng)制而成，方中桑寄生、淫羊藿和黃芪填精益髓補(bǔ)腎，共為君藥，黃精、女貞子、炒杜仲滋補(bǔ)肝腎，與滲濕泄?jié)嶂疂蔀a、行氣活血之川芎共為臣藥，佐以補(bǔ)血活血之當(dāng)歸、引血下行之懷牛膝、清熱熄風(fēng)通絡(luò)之地龍，共同起到補(bǔ)腎益精、活血疏肝之效，臨床用于防治高血壓病，療效較理想[14,16,25-26]。大多數(shù)高血壓患者的確切病因仍未知，中樞神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)、腎功能不全和血管反應(yīng)性改變都與此有關(guān)，但這些異常如何發(fā)生及如何相互作用產(chǎn)生臨床高血壓的機(jī)制尚未明確。高血壓常伴隨著炎癥過(guò)程，免疫細(xì)胞在其中滲透并改變腎臟和血管的功能和結(jié)構(gòu)。這種炎癥反應(yīng)不僅促進(jìn)血壓升高，而且還促進(jìn)與高血壓相關(guān)的終末器官損傷[27]。其次，高血壓發(fā)病還與遺傳、飲食、應(yīng)激、肥胖等相關(guān)，具體機(jī)制尚未完全闡明，目前公認(rèn)的有交感神經(jīng)系統(tǒng)活性亢進(jìn)、水鈉潴留、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活、內(nèi)皮功能異常等[28]。

本研究通過(guò)PPI 拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，IL-6、NOS3、TNF、EGF、VEGFA、PTGS2 等可能是補(bǔ)腎和脈方治療高血壓的核心靶點(diǎn)。IL-6 及TNF 是機(jī)體重要的炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)，其水平降低可能減緩高血壓的進(jìn)程[29-30]。在高血壓的發(fā)病中，血管平滑肌細(xì)胞異常增殖和肥厚占有十分重要的地位。NOS3 是合成一氧化氮（NO）的關(guān)鍵酶，NO 為內(nèi)皮舒張因子，可以舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善血壓[31]。EGF 及VEGFA 都是生長(zhǎng)因子，能夠促使細(xì)胞增殖，其中VEGF 水平升高是新生血管形成的生物標(biāo)志物[32]。PTGS2 可與分布在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞上的前列環(huán)素受體G 蛋白偶聯(lián)受體聯(lián)結(jié)合激活G 蛋白，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平升高，能夠抗血小板凝集，松弛血管平滑肌，參與血管的舒縮功能[33]。因此，結(jié)果提示，補(bǔ)腎和脈方可能通過(guò)作用于這些核心基因，參與其生物過(guò)程而起到降壓作用。

得到的KEGG 通路涉及cAMP信號(hào)通路，cAMP是多種血管活性物質(zhì)的第二信使，一些舒血管物質(zhì)（多巴胺、前列腺素E2、前列腺素I2等）可使腎內(nèi)cAMP 水平升高，從而拮抗血管緊張素Ⅱ的縮血管效應(yīng)[34]。而鈣信號(hào)通路可能通過(guò)選擇性阻滯鈣離子內(nèi)流呈現(xiàn)降壓作用[35]。結(jié)合GO-BP 分析結(jié)果，及拓?fù)涞暮诵陌悬c(diǎn)，推測(cè)補(bǔ)腎和脈方治療高血壓的潛在機(jī)制主要涉及抗炎、RAAS 系統(tǒng)、鈣拮抗劑作用、舒張血管及改善內(nèi)皮功能等方面。

綜上分析，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建了補(bǔ)腎和脈方成分靶標(biāo)-高血壓疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，揭示出補(bǔ)腎和脈方治療高血壓的潛在作用機(jī)制，結(jié)果表明，其治療高血壓是多靶點(diǎn)、多途徑的直接或間接協(xié)同作用，為其臨床應(yīng)用及進(jìn)一步的藥理學(xué)研究提供參考。