基于UPLC的不同產(chǎn)地野菊花多組分定量分析△

魏偉鋒，韓正洲，魏民，李建領(lǐng)，張凱，姚慧穎，王信宏，*

1.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 濟南 250100；3.嘉應(yīng)學(xué)院，廣東 梅州 514031

野菊花為菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序[1]，為清熱解毒類中成藥及相關(guān)制劑的主要原料，生長于草地、田野、路邊等，在民間及臨床上均應(yīng)用廣泛[2-4]。植物化學(xué)研究表明，野菊花主要含有黃酮類、萜類、綠原酸類、葉綠素、微量元素等化合物[5-7]。其發(fā)揮清熱解毒功效的活性物質(zhì)主要為黃酮類和有機酸類化合物[5,8-10]。蒙花苷、木犀草素、芹菜素和木犀草苷為黃酮類化合物中的主要代表性成分，具有抗炎、保肝、抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)、抗菌等多種藥理作用。綠原酸為有機酸類化合物中的代表性成分，具有廣譜抗菌、抗病毒、保肝、利膽、抗腫瘤、降血壓、調(diào)血脂、清除自由基等多種藥理活性[3,11-12]。

中藥的藥效是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，僅檢測蒙花苷的含量不足以準(zhǔn)確評價和比較不同產(chǎn)地野菊花的質(zhì)量。本研究選取了39 份不同產(chǎn)地野菊花樣品，建立了基于超高效液相色譜法（UPLC）的野菊花定量分析方法，同時對蒙花苷、木犀草素、芹菜素、木犀草苷和綠原酸5 個化合物進行定量分析，為野菊花的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 試藥

野菊花樣品均為野生樣品，初花期采收，曬干后保存，產(chǎn)區(qū)信息見表1，經(jīng)華潤三九醫(yī)藥股份有限公司韓正洲工程師鑒定為野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序，憑證樣品存放于華潤三九醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)中心。

表1 野菊花樣品來源信息

對照品綠原酸（純度≥96.6%，批號：110753-201314）、木犀草苷（純度≥94.9%，批號：111720-201609）、木犀草素（純度≥99.6%，批號：111520-200504）、蒙花苷（純度≥96.6%，批號：111528-201710）、芹菜素（純度≥99.6%，批號：111901-201102）均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈、甲醇均購自賽默飛世爾科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

ACQUITY UPLC H-Class 型超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters 公司）；MF10B 型研磨機（德國IKA 公司）；ME36S 型百萬分之一分析天平（德國Sartorius 公司）；XS204 型萬分之一分析天平（瑞士Mettler toledo 公司）；SB-400DTY 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.02%磷酸溶液（B）；梯度洗脫（0～10 min，10%～15%A；10～15 min，15%～25%A；15～30 min，25%～30%A；30～35 min，30%～10%A；35～37 min，10%A）；進樣體積：2 μL；柱溫：（30±5）℃；流速：0.4 mL·min-1；檢測波長：326 nm。

2.2 供試品溶液制備

精密稱定過三號篩（50 目）的干燥野菊花粉末0.2 g，置于100 mL 的具塞錐形瓶中，加入70% 甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（功率：500 W，頻率：40 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，靜置，吸取提取液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液[13]。

2.3 混合對照品溶液制備

精密稱取對照品綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素適量，用甲醇溶解并定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度分別為11.82、20.35、11.11、39.68、10.00μg·mL-1的混合對照品溶液。精確吸取混合對照品 溶液0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL 于10 mL 量瓶中，用甲醇定容，即得系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性與線性關(guān)系考察

分別吸取2.3 項下的系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，5 個成分均能達到基線分離，與相鄰色譜峰的分離度均大于2.0，以各成分色譜峰計算理論塔板數(shù)>2000，且峰形較好，典型的UPLC 色譜圖見圖1。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。結(jié)果顯示，5 個成分在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系均良好（r≥0.999 0）。

圖1 混合對照品與野菊花樣品的UPLC圖

表2 各化合物線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗

精密稱取野菊花混合樣品0.2 g，按2.2 項下方法處理，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素峰面積RSD 分別為0.97%、1.39%、0.65%、1.78%、1.19%，均低于2.0%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取野菊花混合樣品0.2 g，按2.2 項下方法平行制備6 份，按照2.1 項下色譜條件進行UPLC分析，記錄峰面積，綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素峰面積的RSD 分別為1.67%、1.77%、1.82%、1.06%、1.98%，均小于2.0%，表明方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取野菊花混合樣品0.2 g，按2.2 項下方法處理，按照2.1 項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24、48 h 測定，記錄峰面積，計算綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素峰面積RSD分別為1.74%、0.49%、0.13%、1.15%、1.36%，均小于2.0%，表明供試品溶液中的5 個成分在室溫條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的野菊花樣品粉末6 份，精密稱定0.1 g，按2.2 項下方法處理，分別精密加入一定量的綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素對照品溶液，按2.1 項下色譜條件下進樣，記錄峰面積，計算其加樣回收率，結(jié)果見表3，加樣回收率為99.01～99.82%，RSD最高為1.35%。

表3 野菊花5個成分加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 5個成分的定量測定

將39 批野菊花樣品按2.2 項下方法處理，每個批次平行3 份，在2.1 項下色譜條件下進行定量測定，計算各供試品中5 個成分的含量，結(jié)果見表4?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定野菊花中蒙花苷質(zhì)量分數(shù)不得低于0.8%。實驗結(jié)果表明，39 份野菊花樣品中有23 份未達到合格水平，其中廣東（7、8 號）、廣西（11、13 號）、湖北（29、33 號）、重慶（35、36 號）、河南（15 號）地區(qū)9 份樣品未檢測到蒙花苷；湖北隨州樣品（24 號）綠原酸質(zhì)量分數(shù)最高，為5.40 mg·g-1，湖北宜昌樣品（27 號）綠原酸質(zhì)量分數(shù)最低，為0.30 mg·g-1；湖北雙牌野菊花樣品（38 號）木犀草苷質(zhì)量分數(shù)最高，為2.80 mg·g-1，廣西南丹樣品（12 號）木犀草苷質(zhì)量分數(shù)最低，為0.10 mg·g-1；湖南益陽樣品（39 號）木犀草素質(zhì)量分數(shù)最高，為11.90 mg·g-1，湖北隨州樣品（22、24號）木犀草素質(zhì)量分數(shù)最低，為0.60 mg·g-1；湖北監(jiān)利樣品（28 號）芹菜素質(zhì)量分數(shù)最高，為1.10 mg·g-1，河南汝州（16 號）、河南焦作（17 號）、湖南雙牌（38 號）3 份樣品中未檢測到芹菜素。

表4 野菊花5個成分含量測定結(jié)果 mg·g-1

3 分析

3.1 UPLC方法學(xué)研究

UPLC 具有高分離度、高靈敏度、洗脫時間短等優(yōu)點[14-17]。譚曉杰等[18]建立了HPLC 測定野菊花蒙花苷的方法，檢測波長選擇326 nm；崔蘭沖等[19]研究了超聲提取野菊花組分的方法。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究選擇了70%的乙醇超聲提取30 min 的樣品處理方法，采用ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，乙腈-0.02%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，流速為0.4 mL·min-1，柱溫為（30±5）℃，進樣體積為2μL，檢測波長為326 nm。在此條件下，5 個成分線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率試驗結(jié)果表明，此方法可以用于野菊花定量分析。

3.2 不同產(chǎn)地野菊花定量分析

本研究對39 批次野生野菊花進行了定量分析，綠原酸、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素質(zhì)量分數(shù)分別為0.30～5.40、0.10～2.80、0～15.40、0.60～11.90、0～1.10 mg·g-1。說明不同產(chǎn)地野生野菊花各成分含量差異顯著，質(zhì)量參差不齊。建立合理、有效的中藥質(zhì)量評價體系是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的前提之一，本研究的野菊花樣品，按《中國藥典》2020 年版規(guī)定[1]，合格率僅為41.0%，同時有9 份樣品未檢測到蒙花苷。譚曉杰等[18]、崔蘭沖等[19]的研究中也檢測到大量不合格樣品。多種證據(jù)表明僅以蒙花苷含量判定野菊花藥材質(zhì)量不夠全面，仍需深入探討。