甘草地上部分指標(biāo)性成分的確認(rèn)及含量測定研究△

馮鑫，杜裕，邵會涵，劉益江，于冰莉，方永晟，侯俊玲，2，王文全，2，3，劉永剛*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

甘草地上部分約占整株的1/3，生物量占比較大[1]，但目前多以燃料或者畜牧飼料的方式對其進(jìn)行處理，造成了較大的資源浪費(fèi)。經(jīng)研究，甘草地上部分中黃酮類成分含量高[2-4]，并有較好的藥理活性。在我國的新疆地區(qū)，很早就有以甘草葉泡茶飲用來預(yù)防和治療前列腺炎的傳統(tǒng)，也得到了相關(guān)實驗的證實[5-7]，推測甘草葉水提物中的黃酮類物質(zhì)發(fā)揮了主要作用[7]。此外，甘草地上部分還具有一定的抗糖尿病作用[1]。有研究者對甘草地上部分的安全性也進(jìn)行了初步評價，急性毒性分級屬無毒級，相當(dāng)于成年人的日致死劑量>500 g[8]。

本課題組以烏拉爾甘草地上部分為研究對象，對其進(jìn)行提取分離，得到并且鑒定了15 個單體化合物，包括蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素等，其中多為黃酮類成分，而關(guān)于甘草地上部分中指標(biāo)性成分含量測定的研究幾乎為空白。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對這15 個單體成分抗前列腺炎的作用進(jìn)行探究，選取其中重要的單體成分作為指標(biāo)性成分，建立地上部分含量測定的方法，以期實現(xiàn)甘草地上部分的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

島津SPD-M20A 型高效液相色譜儀，光電二極管陣列紫外-可見光檢測器；KH-250 型速控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子天平、BSA124S-CW 型萬分之一電子天平（賽多利斯公司）。

1.2 試藥

甘草地上部分采自甘肅省酒泉市瓜州縣河?xùn)|鄉(xiāng)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的地上部分，編號為S1～S3；對照品蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素均為本課題組自制，通過核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）、質(zhì)譜（MS）等手段確證了其結(jié)構(gòu)，高效液相色譜法（HPLC）檢測純度>98%（面積歸一法）；水為娃哈哈飲用純凈水；乙腈、甲酸、甲醇（色譜級，美國Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析所得單體成分抗前列腺炎作用

2.1.1 化合物靶點(diǎn)與前列腺炎靶點(diǎn)交集的韋恩分析 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索各化合物英文名，獲得并下載其3D 化學(xué)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）得到15 個單體成分（分別為β-谷甾醇、鄰苯二甲酸二丁酯、甘草次酸、刺甘草查耳酮、大豆苷元、木犀草素、山柰酚、對羥基苯甲酸、槲皮素、異甘草素、喬松素、異槲皮苷、水仙苷、蘆丁和短葉松素）可能作用的靶點(diǎn)。通過DigSee（http://210.107.182.61/geneSearch/）和 GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫獲得前列腺炎疾病的作用靶點(diǎn)。

由于檢索到的靶點(diǎn)可能存在命名不規(guī)范等問題，運(yùn)用UniProt（https://www.uniprot.org/）篩選出物種為“人”的靶點(diǎn)，并且將檢索到的蛋白名校正為官方名稱（official symbol），獲得相關(guān)靶點(diǎn)信息。利用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得15 個單體成分作用靶點(diǎn)與前列腺炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)的交集。

2.1.2 抗前列腺炎交集靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò) 所得交集靶點(diǎn)上傳至在線STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），得到交集蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，使用軟件中的“Network Analysis”功能獲得各節(jié)點(diǎn)的介度中心性（BC）、接近中心性（CC）和度（degree）。

2.1.3 抗前列腺炎靶點(diǎn)的基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將抗前列腺炎靶點(diǎn)輸入OmicShare（https://www.omicshare.com/）和 DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）平臺，分別進(jìn)行GO 功能富集分析與KEGG通路富集分析。

2.1.4 結(jié)果

2.1.4.1 所得化合物抗前列腺抗炎作用的靶點(diǎn) 運(yùn)用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫得到15個化合物可能作用的靶點(diǎn)，去重后得到297 個；通過DigSee 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得前列腺炎疾病的作用靶點(diǎn)436 個；利用Venny 2.1 獲得15 個成分抗前列腺炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)45個（圖1）。

圖1 甘草地上部分成分靶點(diǎn)與前列腺炎交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.1.4.2 抗前列腺炎交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò) 將2.1.4.1 項下得到的45 個靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，采用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。PPI 網(wǎng)絡(luò)共有45 個節(jié)點(diǎn)、357條邊，平均度為15.9，平均介度中心性為0.017 6，平均接近中心性為0.587 6。其中度值最高的靶點(diǎn)為蛋白激酶B1（Akt1），其次為表皮生長因子受體（EGFR）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、雌激素受體1（ESR1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、腫瘤壞死因子（TNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、MMP-2（均大于平均度、介度中心性、接近中心性），以上所述靶點(diǎn)均可能為抗前列腺炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)（表1）。核心靶點(diǎn)（前11 個）與成分之間的映射見圖3，可以看出山柰酚、槲皮素、喬松素可能發(fā)揮了抗前列腺炎的重要作用。

圖2 甘草地上部分成分靶點(diǎn)與前列腺炎交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 甘草地上部分成分-核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 甘草地上部分成分抗前列腺炎核心靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

2.1.4.3 抗前列腺炎靶點(diǎn)的GO 功能和KEGG 通路富集分析 依據(jù)P<0.001 篩選出GO 條目377 個，其中生物過程（biology process）341 個、分子功能（molecular function）22個、細(xì)胞組成（cellular component）14個。如圖4所示，生物過程主要涉及細(xì)胞增殖、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)過程等；分子功能涉及催化活性、分子功能調(diào)節(jié)、抗氧化活性等；細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞器、細(xì)胞膜、腔上包膜等。進(jìn)一步富集發(fā)現(xiàn)GO 條目主要聚集在細(xì)胞凋亡、增殖、代謝等，反映了這些化合物在抗前列腺炎作用的過程中涉及體內(nèi)多個生物過程（圖5）。

圖4 甘草地上部分成分抗前列腺炎作用靶點(diǎn)的GO功能分析

圖5 甘草地上部分成分抗前列腺炎作用靶點(diǎn)的GO功能富集

依據(jù)P<0.05 篩得抗前列腺炎靶點(diǎn)KEGG 通路76 條，依P值升序排列且在該通路下的靶點(diǎn)降序排列的前20 條通路見圖6，包括癌癥通路（pathways in cancer）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）等通路。

圖6 抗前列腺炎作用靶點(diǎn)的通路富集

2.2 指標(biāo)性成分含量測定

2.2.1 混合對照品溶液制備 依據(jù)本課題組前期對地上部分提取分離的結(jié)果，喬松素與蘆丁得到量較多；刺甘草查耳酮為甘草屬特有，故以蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素為指標(biāo)性成分。分別精密稱取對照品蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素適量，加甲醇制得質(zhì)量濃度分別為3.26、3.02、4.96 mg·mL-1的單組分對照品儲備溶液；精密吸取上述溶液各1.0 mL，用甲醇定容至100 mL，制得含蘆丁32.6 μg·mL-1、喬松素49.6 μg·mL-1、刺甘草查耳酮30.2 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取烏拉爾甘草粗粉（過0.7 mm 篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液50 mL，密塞，稱量，加熱回流1 h，放冷，稱量，用70%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加10 mL 水溶解，置于分液漏斗中，加入等量乙酸乙酯萃取，至乙酸乙酯層變無色，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘渣加甲醇適量使其溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為35 ℃，以乙腈（B）-0.1%甲酸（A）為流動相，梯度洗 脫（0～9 min，10%～27%A；9～10 min，27%～30%A；10～15 min，30%～33%A；15～18 min，33%～36%A；18～22 min，36%～37%A；22～30 min，37%A；30～32 min，37%～42%A；32～37 min，42%～60%A）；流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為289 nm，進(jìn)樣量為10 μL?；旌蠈φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤旱纳V圖見圖7。

圖7 混合對照品及甘草地上部分樣品色譜圖

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1 項下混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用甲醇溶液定容至10 mL，混勻，制成系列質(zhì)量濃度的線性關(guān)系考察混合對照溶液。分別進(jìn)樣10 μL，按2.2.3 項下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得3 個成分的回歸方程，見表2。

表2 甘草地上部分中3個成分的線性關(guān)系

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.2.3 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，依次測定峰面積，結(jié)果顯示，蘆丁、刺甘草查耳酮和喬松素峰面積的RSD 分別為0.20%、0.45%、0.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，按2.2.3項下色譜條件，于0、1、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示，蘆丁、刺甘草查耳酮和喬松素峰面積的RSD 分別為1.90%、1.20%、1.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批甘草地上部分6份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，并按2.2.3項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，測得蘆丁、刺甘草查耳酮和喬松素峰面積的RSD 分別為1.13%、0.89%、1.10%，表明重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取2.2.4.4 項下已測含量的甘草地上部分粗粉6 份，每份約0.50 g，分別加入蘆丁、刺甘草查耳酮、喬松素對照品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.3 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算樣品中3 個成分的平均加樣回收率及RSD，結(jié)果見表3。

表3 甘草地上部分成分加樣回收率試驗

2.2.5 樣品含量測定 取3 批烏拉爾甘草地上部分樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算樣品中3 個成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 甘草地上部分樣品中3個成分含量測定結(jié)果mg·g-1

3 討論

3.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的甘草地上部分成分抗前列腺炎可能作用機(jī)制探討

基于SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，喬松素可能作用mTOR、ESR1、SRC、PIK3CA、PTGS2 等多個核心靶點(diǎn)來發(fā)揮抗前列腺炎的作用。mTOR 是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，是Akt 最重要的底物之一，而Akt處于PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心部位，在細(xì)胞的增殖、生存及凋亡和細(xì)胞惡變的產(chǎn)生中扮演重要角色。Kinkade 等[9]報道Akt/mTOR 信號通路與前列腺癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)。從表2 可看出，Akt1 度值最高，為核心靶點(diǎn)之一。另外，從圖6 看出，PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)通路富集明顯，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)途徑之一，通過多種重要相關(guān)因子調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的生長、增殖，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動、侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，進(jìn)而治療前列腺炎。有研究指出，與前列腺增生的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的生長因子主要包括表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維生長因子（b-FGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[10]，從圖3 中可以看出山柰酚、異甘草素、槲皮素對EGF 可能具有一定作用。

3.2 指標(biāo)性成分的含量測定

3.2.1 樣品提取方法的選擇 采用甲醇為提取溶劑，分別考察了超聲提取和回流提取方法，發(fā)現(xiàn)回流提取含量較高。考察了30%甲醇、70%甲醇、甲醇、30%乙醇、70%乙醇、乙醇6 種溶劑對提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取率最高，故選用70%甲醇作為提取溶劑。

3.2.2 流動相的確定 考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸4 個溶劑系統(tǒng)。結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%甲酸為流動相，所得色譜峰峰形較好，分離效果最佳。

3.2.3 指標(biāo)性成分的確定 網(wǎng)絡(luò)藥理結(jié)果顯示，山柰酚、槲皮素、喬松素為發(fā)揮抗前列腺炎的重要成分，但在本課題組前期對地上部分含量測定研究中發(fā)現(xiàn)，山柰酚、槲皮素含量低，不易測得，且兩者在藥用植物中廣泛存在，而刺甘草查耳酮為甘草屬特有。依據(jù)本課題組前期對地上部分提取分離的結(jié)果，喬松素得到量最多，這也是選取其作為地上部分指標(biāo)性成分的原因之一。